|
astfel grâului gradul de rezistenţă faţă de rugina
neagră a frunzelor proprii plantei sălbatice.
În ultimul timp la «construirea» plantelor o importanţă tot mai
mare o au cercetările cu protoplaşti izolaţi. În
acest domeniu savanţii din fosta URSS au ocupat cele mai avansate
poziţii în lume. Aceste metode au fost studiate fundamental şi
perfecţionate de un grup de savanţi de la Institutul de fiziologie a
plantelor al AŞ al fostei URSS, condus de R. Butenco.
Protoplaştii pot fi obţinuţi din orice organ al plantei, dar
în majoritatea cazurilor ei sunt separaţi din frunzele verzi. La
început frunzele sunt supuse sterilizării, apoi sunt tratate cu
fermenţi speciali (celulaza, pectinaza ş. a.) care dizolvă
anvelopa groasă :a celulelor, după care conţinutul lor viu
rămâne învăluit într-o membrană subţire
plazmatică. Sunt celulele «goale» sau protoplaştii.
După izolare protoplaştii sunt transferaţi într-un mediu
solid — în geloză, unde peste câteva ore începe să
se formeze peretele celulei. Prima diviziune a celulelor noi începe, de
obicei, peste 3—5 zile, a doua — peste o săptămână, iar
peste încă o săptămână se formează
aglomeraţii de celule, apoi apare şi callusul.
Pentru ca planta să regenereze, celulele de callus se traneferă
într-un mediu cultural special, care contribuie la diferenţierea
organelor. În ultimii ani, din protoplaştii izolaţi au fost
obţinute plante de tutun, morcov, grâu, mazăre,
viţă-de-vie ş. a.
Pentru regenerarea unei plante întregi de tutun din protoplaşti e
nevoie de 7—10 săptămâni.
Cultivarea protoplaştilor prezintă un mare interes pentru ingineria
genetică. În primul rând, pentru că cu ajutorul lor se
pot înmulţi repede exemplare întregi de plantă, deoarece
din fiecare celulă se poate obţine un întreg organism.
Dacă dintr-un gram de frunze verzi se pot separa aproximativ două
milioane de protoplaşti, se crează posibilităţi nelimitate
pentru clonarea plantelor, fapt ce are o mare importanţă
economică. Întreaga descendenţă obţinută din
protoplaştii unei singure plante este identică din punct de vedere
genetic, de aceea această metodă de înmulţire face
posibilă menţinerea pentru un timp nelimitat a
proprietăţilor de valoare ale plantelor cultivate, ceea ce nu se
poate obţine prin înmulţirea sexuată obişnuită.
În rândul al doilea, şi aceasta prezintă cea mai mare
importanţă, cu ajutorul protoplaştilor se pot obţine
aşa-zişii hibrizi asexuali sau somatici ai
diferitelor forme de plante, care nu pot fi creaţi prin nici o altă
metodă. Schema generală a hibridizării celulelor somatice
şi de obţinere prin ele a hibrizilor asexuali este prezentată
în des. 28.
Esenţa acestei tehnologii constă în faptul că drept
materie iniţială de construcţie se utilizează nu celulele
sexuale, ci celulele somatice. După ce se îndepărtează de
pe ele membranele dure, acestea sunt silite să se contopească. Din
celulele hibride, apărute în urma contopirii, se obţin apoi
plante hibride.
Protoplaştii, datorită lipsei membranei de celuloză, pot să
se contopească singuri între ei sau acest proces se produce în
prezenţa unor agenţi chimici, bunăoară a
polietilenglicolului. După contopirea celulelor urmează contopirea
nucleelor lor, apoi, în câteva zile, se restabileşte membrana
celulară comună şi, în sfârşit, celula
hibridă începe să se divizeze.
În anul 1972 un grup de savanţi americani, în frunte cu P.
Carlson, au obţinut primii hibrizi celulari prin contopirea
protoplaştilor a două soiuri de tutun. Din celulele contopite au
regenerat plante hibride normale— amfidiploide, care conţineau cromozomii
ambilor părinţi, 24 de la nicotiana glauca şi 18 de la nicotiana
langsdorfi: în total 2n = 42. S-a constatat că plantele
hibride, obţinute prin metoda contopirii protoplaştilor, nu se
deosebesc prin nimic de cele obţinute prin hibridizare sexuală.
Un grup de savanţi englezi, în frunte cu E. Cocching, au obţinut
în anul 1987 plante hibride prin încrucişarea a două
specii de petunie.
Colaboratorii laboratorului de cultivare a celulelor şi ţesuturilor de
la Institutul de fiziologie a plantelor al AŞ a fostei URSS, în
frunte cu R, Butenco, au obţinut hibrizi somatici din
încrucişarea a două soiuri de tutun, iar, datorită muncii
în comun a savantului sovietic IU. Gleb şi savantului german F.
Hofman, a fost creată o plantă nouă — arabidobrassica.
Şi ea a fost obţinută prin hibridizarea somatică a
arabidopsisului şi a uneia din speciile de varză sălbatică.
Noul hibrid a fost crescut în trei etape. La început, după
contopirea protoplaştilor celulelor somatice ale arabidopsisului şi a
verzei au fost obţinute celule hibride, care aveau cromozomii ambelor
plante iniţiale. Apoi prin înmulţirea unor celule hibride
aparte în condiţiile cultivării sterile în medii
nutritive solide, care conţineau geloză, vitamine, substanţe
minerale şi fitohormoni (auxina şi chinina), au fost
obţinuţi calluşii liniilor celulare respective. În
sfârşit, în etapa a treia, schimbând componenţa
mediilor nutritive, se provoca stimularea celulelor callusului pentru
morfogeneză. Datorită acestei stimulaţii, celulele hibride ale
unor linii formau numai rădăcina, ale alteia — numai lăstarii,
ale celor din urmă — plante întregi cu rădăcini,
lăstari şi flori. Dar plantele înflorite ale arabidobrassicii
nu erau capabile de polenizare. Reproducerea şi înmulţirea lor
este posibilă numai pe cale vegetativă în condiţiile
cultivării ţesuturilor.
Cercetările în domeniul ingineriei celulare a plantelor au atins
stadiul când se poate vorbi despre utilizarea acestei noi metode de
hibridizare la selecţionarea practică a plantelor, cu toate că
în acest caz n-au fost studiate încă definitiv
particularităţile principale ale «comportamentului» genelor, a fost
dovedit că hibridizarea somatică, spre deosebire de cea sexuală,
lărgeşte mult limitele încrucişării.
Hibridizarea celulelor somatice şi-a dovedit de acum eficacitatea. Prin ea
au fost obţinuţi hibrizi interspecifici ai cartofului, tomatelor,
turnepsului, verzei cu rudele lor sălbatice, precum şi hibrizi ai
tutunului şi mahorcăi, tomatului şi cartofului, care
prezintă un material iniţial de valoare pentru selectarea în
viitor a unor soiuri noi. Astfel la una din experienţe savanţii au
utilizat protoplaştii unei specii sălbatice şi a unei specii
cultivate de cartofi — soiul Prieculischii timpuriu. Acest soi are tuberculi
mari, dar este predispus la boli. Cartoful sălbatic are tuberculi foarte
mici, dar este rezistent la diferite boli. Aceste specii se deosebesc şi
după mărimea protoplaştilor, şi dună numărul
cromozomilor.
Ce proprietăţi s-au obţinut la hibrizii somatici? Dacă
comparăm forma frunzelor, a tufelor şi mărimea tuberculilor,
acestea ocupă parcă o poziţie intermediară între
speciile cultivate şi cele sălbatice. Tot aşa se
întâmpla şi la hibridizarea obişnuită, pe cale
sexuală, a acestor plante. Dar hibridul obţinut din protonlaşti
s-a dovedit a fi rezistent la una din bolile virotice grave — la
fitoftoroză.
În cursul ultimilor ani s-au obţinut celule hibride prin contopirea
protoplaştilor şi încrucişând reprezentanţii
unor specii foarte îndepărtate: păpuşoiul cu ovăsul,
morcovul cu tutunul, morcovul cu petuniea, păpuşoiul cu soia,
mazărea cu soia ş. a. m. d., dar din aceste celule hibride nu s-au
obţinut încă plante întregi.
Hibridizarea celulelor somatice, în afară de soluţionarea
problemelor practice, deschide posibilităţi absolut noi în ce
priveşte studierea unei astfel de probleme ştiinţifice
fundamentale, precum este interacţiunea între nucleu,
citoplasmă şi organitele celulei. Până nu demult
încă selecţia şi genetica nu aveau posibilitatea de a
reconstrui genele organelelor citoplasmei, deoarece prin
încrucişarea obişnuită ele se moştenesc numai de la
mamă. Fiind lipsite de genele citoplasmitice ale organismului patern,
între ele nu se poate produce nici o recombinaţie. Pe de altă
parte, aceste gene sunt responsabile de o serie de procese practice importante.
Ingineria celulară oferă pentru întâia dată
posibilitatea de a manipula şi cu aceste gene.
12.4 Transferul interspecific al genelor
Ingineria genică ca mijloc de creare şi transferare a genelor noi e
cea mai potrivită pentru practicarea metodelor ne tradiţionale
în selecţia plantelor cultivate.
Ca început al ingineriei genice a plantelor poate fi considerată
descoperirea vectorului natural al plazmidei mari în bacteriile de sol
Agrobacterium tumefaciens, care provoacă la plantele dicotiledonate
formarea unor tumori — a colţanilor crenelaţi. Adevăratele
tumori apar la plantele capabile să crească nelimitat şi compuse
din celule ne diferenţiate, după ce în ţesutul
vătămat nimeresc bacteriile A. tumefaciens.
În anul 1974 s-a descoperit că caracterul transformării este
determinat genetic de plazmida ce a căpătat de-numirea de Ti (de la
cuvintele engleze tumor inducing — care provoacă tumoare). Această
plazmidă, precum şi plazmida Ri (root inducing) — ce provoacă
roşeaţă), care determină boala tumorală a
rădăcinilor şi care se află în bacteria de sol
înrudită (Argobacterium rhizogenes) formează temelia vectorului
ce transportă informaţia genetică străină în
celulele plantelor.
Plazmidele Ti se află numai în celulele bacteriilor. După ce
pătrund în celulele vegetale, se produce inserarea unei
părţi a ADN-ului plazmidic cu ADN-ul cromozomic al noului
stăpân.
O condiţie obligatorie a fiecărei manipulări de inginerie
genică este transferarea celulei unice datorită inserării
moleculei ADN şi după aceasta clonarea acestei celule. S-a
constatat: celulele vegetale şi protoplaştii lor izolaţi pot
fi şi ei clonaţi. A fost elaborată metoda de inserare a
plazmei Ti prin infectarea protoplaştilor cu bacteria A. tumefaciens.
Posibilitatea transformării plantelor superioare a fost demonstrată
recent de savantul olandez F. Crens împreună cu colaboratorii
săi pe baza protoplaştilor frunzelor de tutun. În prealabil a
fost îndepărtată cea mai mare parte a membranei celulare cu
ajutorul unor fermenţi speciali. Protoplaştii obţinuţi
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65
|
