|
proteine speciale - fermenţii, care-s catalizatori biologici ai
diferitelor procese şi reacţii, ce se produc cu moleculele în
celule. Există un grup de fermenţi, care au o acţiune
specifică asupra ADN-ului şi se utilizează pe larg în
ingineria genetică. Aceştia sunt: restrictazele, ADN-ligazele,
revertazele, transferazele terminale ş. a. m. d. Cel mai des
sunt utilizate în acest scop restrictazele şi ligazele.
Restrictazele funcţionează ca nişte «foarfece» moleculare, iar
ligazele, dimpotrivă, unesc într-un tot întreg moleculele
tăiate de ADN.
Restrictazele, acţionând asupra catenei de ADN, recunosc o
anumită succesiune de nucleotide. În fig. 21 este prezentat
schematic sectorul molecular ADN cu două catene. Restrictaza, numită
Hind II, «recunoaşte» succesiunea compusă din şase nucleotide
GTC, GAC, pe care o taie exact la mijloc.
Restrictaza cu denumirea convenţională RI «recunoaşte» o
altă succesiune a nucleotidelor GAA TTC şi «taie» ADN-ul în
acest loc asimetric, «în trepte». La fel de asimetric, dar în
altă direcţie ADN-ul este tăiat de restrictaza PstI ş. a.
m. d. Toate aceste fragmente tăiate pot fi suturate din nou într-un
tot întreg de fermentul ligaza. În prezent cunoaştem peste
patru sute de restrictaze şi lista lor se completează mereu. Cu
ajutorul fermenţilor polii fragmentelor ADN pot fi lungiţi, din ei
pot fi îndepărtate sectoare aparte, ADN-ul poate fi tăiat exact
în locul necesar, adică genele pot fi separate, croite şi
recroite după voia experimentatorului, ceea ce este foarte important
pentru construirea moleculelor de ADN hibride sau recombinante.
Deoarece savanţii dispun de un număr limitat de gene pentru
obţinerea moleculelor recombinante, ei utilizează în calitate
de surse de gene, în primul rînd, ADN-ul total, fragmentat sau
tăiat în segmente aparte de fermenţii restricţiei.
Această metodă a fost numită metoda fragmentării.
Datorită acţiunii restrictazelor ADN-ul se scindează în
numeroase fragmente, unele dintre ele conţinând gene.
Populaţia acestor molecule de ADN este multiplicată în sistemul
bacterial, după care se selectează genele necesare. La selectare este
folosit de obicei ca probă-test ARNi radioactiv, sau copia ADNc, care
corespunde acestei gene. Această metodă permite separarea atât
a genelor ce se repetă, cât şi a genelor unice.
Dificultăţile legate de selectarea genelor unice se datoresc
concentrării lor mici în ADN-ul total. Astfel, bunăoară,
printre fragmentele de ADN total un fragment de genă unică revine la
un milion de toate celelalte fragmente.
În prezent din ADN-ul total al unei serii de obiecte au fost separate
genele structurale. S. Cohen şi D. Hogness împreună cu
colaboratorii lor au separat pentru prima oară din ADN-ul
ariciului-de-mare şi drosofilii cloni, care conţin gene histonice
şi ribozomice.
La Institutul de biologie moleculară al AŞ al fosteî URSS
(laboratorul lui G. Gheorghiev) în colaborare cu Institutul de energie
atomică I. V. Curceatov (V. Gvozdev şi colaboratorii săi) s-a
obţinut prin intermediul acestei metode o serie de gene structurale din
ADN-ul drosofilei. Deoarece acest obiect a fost bine studiat din punct de
vedere genetic, prezintă interes determinarea directă a
localizării şi funcţiei posibile în cromozom a genelor
separate.
Savanţii au învăţat nu numai să separe din ADN gene
ale diferitelor organisme, dar şi să sintetizeze gene artificiale.
Prima genă artificială, care a început să
funcţioneze, a fost sintetizată de un grup de colaboratori ai
Institutului tehnologic din Massaciusets (SUA) în frunte cu X. Khorana -
laureat al Premiului Nobel. Acasta a fost gena ARNt al tirozinei.
În anul 1970 la Simpoziumul internaţional de chimie ai
compuşilor naturali din oraşul Riga X. Khorana a făcut o
comunicare cu privire la sintetizarea părţii structurale a unei alte
gene - ARNt al alaninei. Acestei gene îi lipseau, însă,
încă câteva părţi componente, şi de aceea n-a
putut funcţiona în celule străine. Tot atunci colaboratorii
laboratorului lui X. Khorana au reuşit să sintetizeze un segment din
85 de perechi de nucleotide, care corespundea succesiunii iniţiale a
ARNt-ului tirozinei. Dar şi această genă ca şi cea a
ARNt-ului alaninei s-a dovedit biologic inactivă.
Mai curând s-a clarificat una din cauzele eşecului - în
celulă se sintetizează la început ARNt-ul precursor compus din
126 de nucleotide. După aceasta un ferment special taie o parte din
molecula precursoare şi abia atunci se transformă în
moleculă lucrătoare. A fost determinată succesiunea acestei
precursoare şi sintetizat segmentul respectiv de ADN compus din 126
perechi de nucleotide. Dar nici Această genă nu era activă din
punct de vedere biologic.
Şi aici a devenit limpede că gena artificială nu va putea
funcţiona în celulă, dacă nu va fi înzestrată
cu sectoare de reglare - cu promotorul care pune în
funcţiune sinteza ARNt-ului şi terminatorul care pune
capăt sintezei. A fost nevoie de metode speciale pentru a determina
succesiunea acestor sectoare de reglare. S-a constatat că promotorul
conţine 59 perechi de nucleotide, iar terminatorul - 21 de perechi. A
fost sintetizată o genă complicată cu promotor şi
terminator. Ba chiar mai mult, pentru ca celula să nu recunoască
în genă un străin, s-a decis că ea să nu se plimbe la
voie, că ea trebuie suturată în ADN-ul celulei. În acest
scop la ambele poluri ale genei sintetizate au fost unite capete «lipicoase» cu
un singur filament. Tocmai aceste poluri se formează în ADN,
când fermentul restrictaza îl taie în bucăţi.
Dacă se va acţiona asupra ADN-ului cu restrictaza, iar apoi se va
adăuga gena sintetică, capetele ADN-ului şi ale genei se vor
lipi unul de altul şi gena se va încorpora în ADN.
Rămâne doar de suturat joncţiunile cu fermentul ligaza.
Savanţii au procedat tocmai aşa. Şi... iar au eşuat.
Bacteria E. coli n-a receptat gena străină. Cercetătorii
erau aproape disperaţi. Şi atunci au încercat să sutureze
gena nu în ADN-ul colibacilului, ci în ADN-ul unuia din virusurile,
care se înmulţesc în această bacterie. De data aceasta
savanţii au lucrat bucurându-se de succes: după ce celula
colibacilului a fost infectată cu virusul, în gena căruia a
fost încorporată gena artificială, bacteria a început a
sintetiza ARNt-ul codificat în această genă.
Aşa dar, a început a funcţiona prima genă sintetică.
De atunci familia genelor sintetice artificiale creşte mereu.
Îndată ce a fost descoperit fenomenul reverstran-scripţiei,
adică procesul de transferare a informaţiei genetice de la ARN la ADN,
savanţii au început să vorbească despre posibilitatea unei
noi căi, fermentative, de sinteza genei.
Pentru această sinteză serveşte ca matriţă ARN-ul,
care se elaborează în celulă şi prezintă, precum
ştim, o copie complementară a unui fragment anumit al ADN-ului.
După ce am separat acest ARNi, putem obţine prin transcriere
inversă o moleculă de ADN complementară ei. Probabil că ea
va fi o copie fidelă a genei iniţiale.
Primele experienţe reuşite de sintetizare fermentativă a genei au
fost efectuate în laboratoarele din străinătate în anul
1972.
În anul 1973 L. Chiseliov şi L. Frolova, colaboratori la Institutul
de biologie moleculară, precum şi C. Gazarean şi V. Tarantul de
la Institutul de energie atomică «Curceatov», dirijaţi de
academicianul V. A. Enghelgard, au obţinut partea informatică a
genei, globina, utilizând matriţa ARNi-ului globinic din celulele
porumbelului.
În acest timp în cadrul proectului «revertaza» a activat
şi un alt grup de savanţi - V. Cavzan şi A. Rândici de la
Institutul de biologie moleculară şi genetică al AŞ
Ucrainene, care au reuşit şi ei să sintetizeze gena
globină, utilizând drept matriţă ARNi-ul globinic al
iepurelui de casă, nu al porumbelului.
În anul 1979 s-au soldat cu succes lucrările de sintetizare a
genelor de bradichinină, datorită eforturilor comune ale
savanţilor de la Institutele de genetică generală şi de
chimie bioorganică şi de anghiotenzină - de către
savanţii Institutului de citologie şi genetică al AŞ a
Federaţiei Ruse.
În anul 1981 la Institutul de biologie moleculară un grup de
colaboratori (S. Deev, N. Barbacari, O. Poleanovschii ş. a.) au sintetizat
şi au transferat într-o celulă bacteriană o genă care
codifica una din catenele uşoare ale imunoglobulinei. Mai târziu
în ţara noastră, cât şi în laboratoarele
străine au fost sintetizate multe gene: a somatostatinei, somatotropinei,
insulinei, interferonului ş. a. care şi-au găsit aplicare
largă în practică.
10.4 Clonarea genelor
Genele separate din alte organisme sau sintetizate artificial pe cale
chimică. fiind transferate în celule noi, nu sunt în stare
să se reproducă nici să se transmită descendenţei
acestor celule. Acest lucru se poate obţine, dacă ele se vor
introduce în prealabil în componenţa structurii genetice,
care are un aparat propriu de reproducere. În ingineria genetică
această structură este cu adevărat figura centrală
în toate manipulările ingineriei genice. poartă numele de
vector, sau «transportor».
Vectorul este o moleculă de ADN capabilă să transfere în
celulă o genă străină şi să asigure acolo
înmulţirea ei, sintetizarea produsului proteic şi
încorporarea în cromozom.
De cele mai multe ori în calitate de vector sunt utilizate plazmidele
bacteriilor, virusurile bacteriilor (bacteriofagii) şi virusurile
animalelor, precum şi cosmidele, care conţin elemente genetice ale
plazmidelor şi ale bacteriofagilor.
Molecula-vector trebuie să aibă capacitatea de replicare
autonomă şi să conţină anumite gene de semnalare
(marcatori), bunăoară gene de rezistenţă la antibiotice,
care permit descoperirea şi identificarea celulelor modificate.
Plazmidele sunt larg răspândite în lumea bacteriilor. Sunt,
precum s-a notat mai sus, mici molecule inelare de ADN, care se află
în celulele bacteriale. Poate fi o moleculă sau câteva.
Plazmida conţine genele necesare pentru reproducerea ADN-ului şi
genele rezistente la antibiotice, de exemplu la ampicilină şi
tetraciclină, precum vedem în fig. 22.
În interiorul acestor gene se află fragmente pe care le recunosc
restrictazele. Asemenea fragmente există bineînţeles şi
în alte locuri ale plazmidei, dar cele din interiorul genelor de
rezistenţă sunt deosebit de importante, deoarece anume acolo se
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65
|
