|
генетической информации в клетки эукариот с использованием в
качестве лигандов специфических антител, рецепторных белков,
а также вирусных последовательностей и липосом позволяет в
одной системе совместить преимущества физико-химических ме-
тодов переноса ДНК и вирусных векторов и потому представляет
один из наиболее перспективных и быстро развивающихся нап-
равлений в трансфекции эукариотических клеток.
9.4.4 Рекомбинантные вирусы.
Конструирование векторов на базе вирусов представляет
собой наиболее интересный и перспективный раздел генотера-
пии. Эволюционно сложившаяся система обеспечения эффективно-
го проникновения в клетки-мишени, а в случае ретровирусов и
система интеграции в клеточный геном, позволяет рассматри-
вать вирусы как естественные векторы чужеродной ДНК для кле-
ток млекопитающих. Действительно, только с помощью вирусных
векторов пока удается достичь такого уровня трансфекции кле-
ток человека in vitro и in vivo, который необходим для про-
явления лечебного эффекта. Это доказывают многочисленные
эксперименты на животных и первые клинические испытания ут-
вержденных программ генотерапии (см. 9.2). Вместе с тем,
нельзя недооценивать и вполне реальную опасность патологи-
ческих процессов, связанных с использованием вирусных час-
тиц. В качестве векторов применяют следующие рекомбинантные
вирусы: ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные виру-
сы, вирус герпеса, вирус спида (HIV), вирус ветряной оспы и
некоторые другие (Anderson, 1992; Culver, 1994; Lowenstein,
1994; Hodgson, 1995; Kay, Woo, 1992). Учитывая большую прак-
тическую значимость этих векторов, рассмотрим их более под-
робно.
_Ретровирусные векторы. . Генные конструкции на основе
ретровирусов (РНК-содержащих вирусов) особенно часто исполь-
зуются для трансдукции ДНК ex vivo. Наиболее популярный рет-
ровирусный вектор - вирус мышиного лейкоза Molony (MoMLV).
По сравнению с другими типами векторов ретровирусы обладают
уникальной способностью эффективно переносить чужеродные ге-
ны и стабильно интегрировать их в геном делящихся соматичес-
ких клеток. Для безопасности ретровирусные последовательнос-
ти модифицируют таким образом, что в инфецированных ими
клетках вирусные белки не производятся. Это достигается за
счет удаления или инактивации всех кодирующих последователь-
ностей вируса. Репликация вирусных векторов может происхо-
дить только в специальных "пакующих" клетках, в геном кото-
рых встроены все гены, производящие вирусные белки. При вве-
дении ретровирусных векторов в эти клетки образуются вирио-
ны, несущие векторную РНК и способные лишь проникать в клет-
ки-мишени, но не размножаться в них. Недостатком этой систе-
мы, также как и других векторных систем на основе вирусов,
является возможность контаминации производящей клеточной ли-
нии нормальным ретровирусом и получения на этой основе ком-
петентного по репликации вектора. Для предотвращения этого
необходимо регулярное тестирование "пакующей" линии клеток.
Возможна также контаминация ретровирусного вектора клеточны-
ми РНК, некоторые из них могут обратно транскрибироваться и
встраиваться в геном трансдуцированных клеток. Последстия
такого события могут быть выявлены в экспериментах на живот-
ных моделях. Другими серьезными недостатками ретровирусных
векторов является: (1) их способность переносить генетичес-
кий материал только в пролифирирующие клетки; (2) способ-
ность индуцировать мутации при случайной интеграции в геном;
(3) возможность спонтанной активации онкогена; (4) небольшие
размеры переносимой ДНК-вставки - до 8 тысяч п.о.; (5) срав-
нительно низкий титр -10!6-10!7/мл рекомбинантных вирусных
частиц, получаемых для трансдукции; (6) необходимость конс-
труирования соответствующих "пакующих" клонов клеток.
_Аденовирусные векторы. . В отличие от ретровирусов адено-
вирусы активно инфецируют неделящиеся клетки, обладают боль-
шей потенциальной пакующей способностью (ДНК-вставка> 8 кб),
имеют высокий титр - 10!11/ мл, однако, не обеспечивают
встраивание чужеродной ДНК в геном трансформированной клетки
(Hodgson, 1955). Использование их перспективно для генокор-
рекции клеток верхних дыхательных путей, легких и других ор-
ганов - мозга, печени, мышц, кожи и пр. Они эффективны при
доставке аэрозольным способом, что было использовано в пер-
вых клинических испытаниях по генотерапии муковисцидоза
(Crystal et al., 1994). В аденовирусные векторы также инсер-
тируют маркерные гены - neo, CAT или бета-галактозидазный
ген (бета-Gal) для того, чтобы идентифицировать трансдуциро-
ванные клетки. Для конструирования векторов используют де-
фектные по репликации аденовирусы, которые получают путем
вырезания из вирусной ДНК генов, кодируюших белки (E1a,
E1b)- так называемые аденовирусные векторы 2-го поколения. В
настоящее время создаются аденовирусные векторы 3-го поколе-
ния, в которых помимо генов Е1а и Е1b удаляют и регуляторный
ген Е4. Такая конструкция может поддерживаться только в при-
сутствии клеток-хелперов (например, в культуре клеток почек
человека). Удаление большего числа аденовирусных генов из
векторов часто сопровождается их дестабилизацией. Это один
из главных недостатков аденовирусных векторов, так как в ря-
де случаев остающиеся гены, трансдуцированные в клетки-мише-
ни, способствуют формированию иммунного ответа. Именно выра-
женный иммунный ответ при повторных введениях аденовирусного
вектора с инсерцией гена CFTR, оказался наиболее серьезным
препятствием для успешной генотерапии муковисцидоза (Crystal
et al., 1994). Некоторые аденовирусные белки способны оказы-
вать цитотоксический эффект на высокоспециализированные
клетки человека. Схема поддержания аденовирусных векторов
сходна с той, которая используется для производства ретрови-
русных векторов. Велика опасность их контаминации хелперным
реплицирующимся вирусом. Кроме того, аденовирусы редко ин-
тегрируются в геномную ДНК и потому экспрессия переносимых
ими генов, как правило, носит временный характер
(Табл. 9.1). Способность инфецировать, практически, любые
клетки как in vivo, так и in vitro делает особенно актуаль-
ной адресную доставку таких конструкций и введение в их сос-
тав тканеспецифических промотров. Например, промотор гена
альфа-фетопротеина при необходимости экспрессии гена в клет-
ках печени, либо промоторы генов сурфактантных белков В и С
для экспрессии чужеродных генов в клетках легких.
_Аденоассоциированные вирусы . обладают значительно мень-
шей пакующей способностью (около 5 кб). Однако, в отличие от
ранее рассмотренных вирусов не обладают онкогенной актив-
ностью, не патогенны, способны интегрироваться в геном, где
пребывают в латентном состоянии. Уникальной особенностью AAV
является их способность к стабильной неслучайной интеграции
в один из районов хромосомы 19. Специфичность интеграции ви-
руса определяется наличием в его геноме гена rep. Близко
родственные AAV, так называемые, парвовирусы (H1, MVM, Lu-
III), обладают еще меньшей пакующей способностью - около 2
кб и не имеют специфичного встраивания, однако, они также
рассматриваются как потенциально перспективные векторы.
_Вирус простого герпеса (HSV). . Крупный (152 кб) ДНК-со-
держащий вирус, при трансформации не интегируется в геном,
формируя в ядрах эписомные структуры. Уникальная особенность
HSV является его выраженная тропность к клеткам нервной сис-
темы. Отсюда его перспективность как векторной системы для
лечения опухолей мозга, болезни Паркинсона и многих других.
Его известное преимущество - достаточно большая пакующая
способность (>30кб). Важным этапом в создании вектора на ос-
нове HSV является удаление из его генома области ICP22, от-
ветственной за синтез литических белков, и индукция мутации
1814, вызывающей блок транскрипции вирусной ДНК. В последнее
время на основе HSV стали получать искусственные производные
вируса, так назывемые ампликон-продукты, лишенные, практи-
чески, всех генов HSV, но способные к репликации .
Конструкции векторов, используемых для переноса экзо-
генных ДНК в клетки человека, постоянно совершенствуются в
зависимости от типа клеток-мишеней. Так, новый тип векторов,
сконструированных на основе псевдо-аденовирусов, сочетает в
себе все преимущества аденовирусных векторов, но при этом
собственные вирусные гены, практически, не оказывают никако-
го повреждающего эффекта на трансфецированные клетки-мише-
ни, так как содержат очень мало регуляторных элементов и
последовательностей, ответственных за упаковку и репликацию
аденовируса. Кроме того, псевдо-аденовирусные векторы с ус-
пехом переносят чужеродные последовательности ДНК как в де-
лящиеся, так и в покоящиеся клетки. Изучаются также перспек-
тивы использования для генной терапии других вирусных сис-
тем, таких как SV40, вирус иммунодефицита (HIV), вирус вет-
ряной оспы и многие другие. В частности, заслуживают внима-
ния эписомные (неинтегрирующиеся в геном реципиента) векто-
ры, полученные на основе очень крупного вируса Эпштейн-Бар-
ра, способного нести вставку размером от 60 до 330 кб (Sun
et al., 1994).
9.4.5 Перспективы создания "идеальных" векторных систем.
Обзор существующих данных позволяет придти к заключе-
нию, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все
уже известные и испытанные in vivo и in vitro векторные сис-
темы далеки от совершенства (Hodgson, 1995). Если проблема
доставки чуужеродной ДНК in vitro практически решена, а ее
доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно реша-
ется (главным образом, путем создания комбинированных рецеп-
тор-опосредованных конструкций), то другие характеристики
существующих векторной системы - стабильность интеграции,
регулируемая экспрессия, безопасность - все еще нуждаются в
серьёзных доработках. Прежде всего, это касается стабильнос-
ти экспрессии. Последняя может быть достигнута либо при ин-
теграции чужеродной ДНК непосредственно в геном реципиента,
либо путем обеспечения длительной персистенции экзогенной
ДНК в ядре. До настоящего времени интеграция в геном дости-
галась только при использовании ретровирусных либо адено-ас-
социированных векторов (Табл. 9.1). Случайная интеграция
трансфектной ДНК в геном происходит достаточно редко, причем
в случае ретровирусных векторов это происходит только в де-
лящихся клетках. Повысить эффективность стабильной интегра-
ции можно путем совершенствования генных конструкций типа
рецептор-опосредованных систем (Рис. 9.2). Однако, эти век-
торные конструкции должны включать только часть вирусных ге-
нов, например, гены обратной транскриптазы, ретровирусной
интегразы, некоторые транспазоновые гены, парвовирусные
rep-гены (см. 9.4.4). Учитывая возможный мутагенный эффект
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
