|
используемых для клонирования : pBR322 и ColE1. Это позволя-
ет проводить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не
вырезая предварительно инсертированный в нее фрагмент. Для
создания библиотек клонов, содержащих большие районы ДНК,
используется технология искусственных дрожжевых хромосом
-YAC. Последние представляют собой крупные (до 1 млн п.о.)
фрагмены геномной ДНК человека, сшитые с центромерными райо-
нами хромосом дрожжей. После идентификации в таких библиоте-
ках нужных клонов с инсертированными фрагментами чужеродных
ДНК последние могут быть субклонированы в фаговых или
космидных библиотеках.
Скрининг библиотек проводят путем гибридизации на
фильтрах с олигонуклеотидными, кДНК-овыми или любыми иными
ДНК-зондами, а также с помощью антител, если библиотека
сконструирована на основе экспрессионного вектора (рис.1.7).
Для этого химерные фаги, составляющие библиотеку, высевают
на плотно растущий в чашках Петри газон бактерий таким обра-
зом, чтобы образовались отдельные литические бляшки в ре-
зультате инфецирования клеток одним рекомбинантным фагом.
Все культуры дублируют путем отпечатка - реплики, на другие
чашки Петри. Затем на исходные культуры накладывают фильтры
и переносят на них растущие и лизированные колонии, проводят
их разрушение, фиксацию белков и ДНК на фильтре и блот гиб-
ридизацию с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными ан-
тителами (для экспрессионных библиотек). После отмывки филь-
тров от несвязавшихся меченых зондов и радиоавтографии на
рентгеновской пленке проявятся темные пятна в местах локали-
зации колоний, содержащих в инсертированном фрагменте ДНК
последовательности, комплементарные зонду, или специфические
антигены. Отбор положительных колоний фагов на дублированных
культурах производят именно в тех местах, где произошло по-
темнение пленки. Чтобы избежать возможного загрязнения,
отобранные колонии размножают и вновь подвергают скринирова-
нию. Обычно, инсертированную ДНК изолируют из бактериофага и
субклонируют в плазмидном векторе, позволяющем наращивать
большие количества этой ДНК.
1.6 Секвенирование последовательностей ДНК.
Следующими этапами анализа отобранного и клонированного
ДНК фрагмента являются его физическое картирование и опреде-
ление нуклеотидной последовательности, то есть секвенирова-
ние. Методология секвенирования достаточна проста и заключа-
ется в том, чтобы получить серию комплементарных молекул
ДНК, различающихся по длине на одно основание. На практике,
однако, определение нуклеотидной последовательности протя-
женных молекул ДНК представляет собой весьма трудоемкую за-
дачу. Существует два основных метода секвенирования: хими-
ческое - метод Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование -
метод Сэнджера. В первом случае используют химическое
расщепление ДНК по одному основанию, во втором - синтезируют
нужную цепь ДНК in vitro, специфически останавливая синтез
на заданном основании.
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так
как он более надежный и простой в исполнении. Принцип данно-
го метода показан на рис.1.8. На первом этапе ДНК денатури-
руют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют
секвенирующий праймер - искусственно синтезированную олиго-
нуклеотидную последовательность, комплементарную определен-
ному участку исходной молекулы ДНК. Создают условия для гиб-
ридизации праймера, то есть для образования двухцепочечного
участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную
смесь ДНК-полимеразу и трифосфаты - dATP, dCTP, dGTP и dTTP,
один из которых является радиоактивным. Синтез ведут в четы-
рех параллельных пробирках, в каждую из которых добавляют
один из специфических дидезоксинуклеотидов или терминаторов
- ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTP. При встраивании ddNTP на
место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается.
Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различаю-
щихся по длине радиоактивномеченых фрагментов ДНК с одним и
тем же специфическим для данной пробирки дидезокситерминато-
ром на конце молекулы. После одновременного электрофорети-
ческого разделения этих фрагментов на четырех соседних до-
рожках и радиоавтографии, размер синтезированных фрагментов
может быть определен, а значит и определена локализация ди-
дезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов
в исходной молекуле ДНК (Рис.1.9). На каждом секвенирующем
геле может быть определена первичная последовательность все-
го около 500 пар оснований. В своем первоначальном варианте
этот метод является достаточно трудоемким и дорогостоящим.
Достаточно заметить, что цена одного звена (шага) в цепи ДНК
в Международной Программе "Геном человека" еще несколько лет
назад оценивалась в 1$.
В качестве модификаций метода Сэнджера используют пред-
варительное клонирование ДНК в векторах, сконструированных
на основе фага M13, для получения протяженных однонитевых
участков ДНК, которые могут быть непосредственно секвениро-
ваны без денатурации и праймирования. Очень эффективной ока-
залась система векторов mp8 и mp9, позволяющих вести сиквенс
одовременно в обоих направлениях и прочитывать участки боль-
шей протяженности. Интенсивно разрабатывается методология
автоматического ДНК секвенирования. Особенно перспективным
для массового секвенирования в автоматическом режиме оказа-
лось применение меченых различными флюорохромами дидеокси-
нуклеотидов. В этом варианте каждому из нуклеотидов соот-
ветствует свой цвет полосы в геле, который легко учитывается
автоматически. Этот метод нашел особенно широкое применение
в реализации программы Геном человека. По последним данным,
разработка автоматических секвенаторов позволила снизить
стоимость одного звена до 0,5$ и резко повысить эффектив-
ность этого процесса. Так, на 30 автоматических секвенаторах
фирмы Applied Biosystems за одну неделю работы в 1994г.мож-
но было просеквенировать до 1 млн пар оснований.
В последние годы активно разрабатываются принципиально
новые, более эффективные и экономичные методы секвенирова-
ния. Особенно перспективным на сегоднешний день представля-
ется метод секвенирования путем гибридизации исследуемой
последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов, так назы-
ваемой олигонуклеотидной матрицей (Мирзабеков, 1990; Барский
и др.,1994; Southern, et al, 1992). Наиболее удобными для
этой цели являются наборы матриц - чипы, в ячейках которых
пришиты (иммобилизованы) октануклеотиды. Суть данного подхо-
да в том, что пришивается набор всех возможных вариантов пе-
рестановок из 4-х стандартных нуклеотидов (А,Г,Ц,Т) опре-
деленной длины, при этом в случае октануклеотидов количество
возможных вариантов нуклеотидов составляет 65536. Секвениру-
емый фрагмент ДНК метят радиоактивным фосфором и гибридизуют
с октануклеотидной матрицей. Фрагмент ДНК гибридизуется
только с теми октануклеотидами, последовательности которых
комплементарны его участкам. Таким образом, определяется на-
бор всех возможных октануклеотидов, присутствующих в иссле-
дуемом фрагменте ДНК. После этого, при помощи специальной
компьютерной обработки упорядочивается расположение этих ок-
тамеров в изучаемом фрагменте ДНК. Этот перспективный метод
позволяет значительно ускорить время секвенирования за счет
автоматизации процесса.
1.7 Полимеразная цепная реакция.
До недавнего времени гибридизация с ДНК-зондами и клони-
рование являлись единственными способами поиска и выделения
специфических геномных или к-ДНК-овых последовательностей
ДНК с целью их дальнейшего исследования. Не говоря уже о
большой трудоемкости этих методов, они имеют ряд принципи-
альных недостатков и ограничений. Во-первых, исследуемые
фрагменты значительно превосходят по длине ДНК-зонды и слиш-
ком велики для прямого молекулярного анализа. Концы этих
последовательностей не могут быть выбраны произвольно, так
как определяются наличием соответствующих рестрикционных
сайтов в исследуеммой молекуле ДНК. Во-вторых, для проведе-
ния успешной рестрикции и гибридизации необходимо большое
количество хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДНК
(не менее 10 микроГ на одну реакцию). Такое количество ДНК
обычно получают из 3- 5 мл крови. Часто это количество ока-
зывается слишком большим, если учесть, что речь идет о детях
и о тяжело больных людях. Кроме того, необходимость немед-
ленного использования собранной крови для выделения ДНК или
хранения ее до использования при -20 С затрудняет исследова-
ние нетранспортабильных пациентов или родственников, прожи-
вающих на отдаленном расстоянии от исследовательских цент-
ров. В-третьих, для геномной гибридизации, как правило, не-
обходимы радиоактивные ДНК-зонды с высокой удельной актив-
ностью, не менее 10!8-10!9 имп./мин/мкГ., причем они должны
быть использованы в течение очень короткого периода после их
приготовления. Кроме того, работа с радиоактивным материалом
требует соблюдения необходимой техники безопасности и нали-
чия специально оборудованного изотопного блока, что возможно
лишь для некоторых диагностических центров. В-четвертых, не-
обходимость длительной экспозиции автографов значительно уд-
линяет время получения результатов, что также ограничивает
использование методов блот-гибридизации для пренатальной ди-
агностики плода, специфика которой во многом определяется
сроком беременности.
Предложенный в 1983г. американским исследователем
Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской
премии в 1993г., альтернативный метод анализа геномной ДНК -
метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), явился эпохальным
открытием молекулярной биологии нашего века. Метод ПЦР или
специфической амплификации ДНК позволяет избирательно синте-
зировать in vitro относительно небольшие участки ДНК, длиной
от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов,
реже до 1000 - 2000 п.о., используя в качестве матрицы любые
образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность.
Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нук-
леотидной последовательности амплифицируемой области ДНК,
так как специфический выбор этого участка осуществляют путем
гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезиро-
ванными праймерами - олигонуклеотдными последовательностями
ДНК, длиной, обычно, от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-
концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой
нитях ДНК, соответственно. Таким образом, расстояние между
праймерами определяяет длину синтезируемых молекул. В ка-
честве матрицы для синтеза может быть использован любой тип
ДНК - геномная ДНК отдельных индивидуумов различных видов
про- и эукариот; ДНК, выделенная из культур клеток, бактери-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
