|
РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспорт-
ных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связыва-
ется с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает
доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами
(Рис. 2.2). После того как первый нуклеотид РНК инкорпориру-
ется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает
продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая
двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот
процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала,
представляющего собой один или несколько терминирующих кодо-
нов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная
спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.
Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное
взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс
контролируется промотором - специальной регуляторной после-
довательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной,
как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под
контролем одного промотора считывается несколько генов c об-
разованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные
области различных генов довольно разнообразны по своему нук-
леотидному составу. Однако, почти для всех промоторов харак-
терно наличие консервативной последовательности из 7 основа-
ний на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации
транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хог-
несса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимера-
зы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 - 80
п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто
расположена другая консервативная последовательность из 9
п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание
РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут су-
щественно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей
области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала
его кодирующей части располагаются другие регуляторные
последовательности, так называемые инхансеры (усилители),
способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличе-
ния скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут
работать независимо от их ориентации по отношению к сайту
инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавля-
ющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (осла-
бители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации
транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать прод-
вижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму
контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция
экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции,
трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти
механизмы более детально рассмотрены в других разделах.
Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
рикции, ПДРФ-анализ.
Кодирующие и регуляторные области структурных генов на-
иболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в
них подвержены давлению жесткого естественного отбора.
Действительно, небольшие изменения в этих последователь-
ностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция
нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза
белка или к потере его функции, что, как правило, драмати-
ческим образом сказывается на жизнеспособности особей, несу-
щих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека
состоит из некодирующих последовательностей, подобных сател-
литным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным проме-
жуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы
и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или
полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не
оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репро-
дуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных
прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы
являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа
родословных можно проследить их наследование в ряду поколе-
ний, проанализировать сцепление друг с другом, с известными
генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть
использовать в качестве обычных менделевских признаков в
классическом генетическом анализе. Информативность полиморф-
ных локусов определяется уровнем их генетической изменчи-
вости в различных популяциях.
Экспериментально легко выявляются два варианта геномно-
го полиморфизма. Количественые изменения в области локализа-
ции мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и ка-
чественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появ-
лению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае измен-
чивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию
аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого
вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан
с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых,
как правило, в уникальных последовательностях некодирующих
участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генети-
ческого кода (см.Глава 1) могут возникать и в кодирующих
последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в
сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре-
зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом,
при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.
Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хро-
мосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на
300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и исполь-
зован для молекулярной маркировки специфических участков ге-
нома исторически раньше по сравнению с вариабильными сател-
литными повторами (Botstein et al.,1980).
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть
легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагмен-
тов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Ана-
лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы-
ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном-
ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро-
форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден-
тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест-
рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).
При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо-
реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения
ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот-
ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя
соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо-
нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на
электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам
фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест-
рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С
каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному
локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа-
ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае
возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест-
рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-
тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест-
рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак-
тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в
десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда-
ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по-
лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты
изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию
и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте
ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-
личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли-
ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо-
мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об-
ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в
нижней области геля, соответствующий более короткому фраг-
менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по-
лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в
верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,
тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,
если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер-
жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния
этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп-
лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в
исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента
не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа-
зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области
сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины
(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,
один из которых по длине будет соответствовать размеру амп-
лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же
суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова-
ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож-
ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных
варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по-
лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге-
нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон-
дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной
нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют
широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде-
ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих
собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят
ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име-
ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из
популяций аналогичные исследования проводят в других популя-
циях.
Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции
всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да-
же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге-
терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет
превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного
сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный
аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную
маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по-
лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо
более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными
сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель-
ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -
90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
