|
2,2 миллионов пар оснований), где вероятность внутригенного
кроссинговера по некоторым данным может достигать 2-2,5%.
Раздел 7.5 Доимплантационная диагностика, точность прог-
нозирования.
Следует подчеркнуть, что общий подход к молекулярному
тестированию, практически, не зависит от формы нозологии,
так как для анализа генов и мутантных аллелей используется
один и те же методы (см. Глава IV). При наличии у больного
или у его родителей идентифицируемых мутаций или при нахож-
дении информативных для данной семьи ДНК-маркеров проведение
пренатальной диагностики становится возможным на любой ста-
дии развития и при любом сроке беременности.
ДНК-диагностика на начальных этапах развития человека,
безусловно, имеет свои методические особенности и тесно соп-
ряжена с приемами экстракорпорального оплодотворения и
трансплантации зародышей. Эти обстоятельства позволяют выде-
лить ее в самостоятельное научно-практическое направление -
доимплантационную диагностику генных и хромосомных болезней
(Verlinsky, Kuliev, 1993). Несмотря на очевидные успехи в
этой области, достигнутые в ряде зарубежных лабораторий (до-
имплантационная диагностика муковисцидоза, некоторых X-сцеп-
ленных заболеваний - миодистрофии Дюшенна, синдрома ломкой X
-хромосомы, гемофилии), данное направление исследований все
еще находится на уровне научных разработок и не имеет широ-
кого применения. Объектом ДНК-диагностики на этих стадиях
развития могут служить полярные тельца овулировавших яйцек-
леток и отдельные бластомеры зародыша, полученные методом
микрургии (Рис.7.2). Недостатком этого подхода является
сравнительно невысокий процент (до 30%) приживаемости опери-
рованных зародышей после их искусственной трансплантации в
матку. Подробно с методами доимплатационной диагностики, её
современным состоянием и перспективами можно ознакомиться в
уже цитированной монографии (Verlinsky, Kuliev, 1993). Есть
определенные основания считать, что в связи с быстрым ростом
числа центров экстракорпорального оплодотворения в Рос-
сии, заметным увеличением эффективности их работы, оценивае-
мой по числу наступивших беременностей и родов, методы доим-
плантационной диагностики наследственных болезней будут
привлкать к себе все большое число исследователей. Однако,
практическая значимость такого подхода в виду его высокой
стоимости и недостаточной надежности еще сравнительно долго
будет оставаться проблематичной, по крайней мере, в нашей
стране.
Обобщенный опыт различных молекулярных диагностических
центров мира свидетельствует о том, что оптимальным для пре-
натальной диагностики является первый триместр беременности
(10-12- недели), поскольку при неблагоприятном прогнозе бе-
ременность может быть прервана обычным медицинским абортом.
Зачастую молекулярную диагностику проводят и во втором три-
местре беременности (обычно на 17-21 неделях). Необходимые
для анализа образцы ДНК плода выделяют из биоптатов хориона
(плаценты), клеток амниотической жидкости (амниоцитов) или
из лимфоцитов пуповинной крови при помощи соответствующих
инвазивных процедур - хорионбиопсия, плацентобиопсия, амнио-
центез или кордоцентез, которые проводятся под контролем уль
тразвука (Рис. 7.3). Подробнее об этих методах, их преиму-
ществах и недостатках можно узнать в соответствующих моног-
рафиях и обзорах (Рарр,1992; Баранов, 1994; Баранов и др.,
1994). Диагностика во 2-м триместре беременности нередко по-
казана для неинформативных семей в случае тех нозологий,
пренатальная диагностика которых принципиальна возможна пу-
тем биохимического тестирования первичных нарушений (напри-
мер муковисцидоз) или оценки каких-либо иных проявлений бо-
лезни у плода.
Основным источником ДНК для диагностики в постнатальном
периоде являются лимфоциты крови. Реже для этих целей ис-
пользуют другие ткани и биологические жидкости, содержащие
клеточные элементы (слюна, кости, моча). Если семья частично
информативна (идентифицируется либо доступен молекулярной
маркировке лишь один мутантный аллель), также рекомендуется
диагностика в 1-м триместре беременности, так как она позво-
ляет отвергнуть диагноз у 50% всех плодов при аутосомно-ре-
цессивных заболеваниях, что доказывается отсутствием иденти-
фицируемого мутантного аллеля. В противном случае дальнейшая
тактика определяется исходя из пожеланий женщины и возмож-
ностей для уточнения диагноза на более поздних сроках разви-
тия (II-й триместр беременности). Так, в случае пренатальной
диагностики муковисцидоза результаты молекулярных исследова-
ний могут быть дополнены биохимическим тестированием фермен-
тов амниотической жидкости на 18- 20-й неделях беременности
(Горбунова и др., 1991; Baranov et al., 1992); в случае ге-
мофилии А - прямым серологическим исследованием активности
фактора Y11 свертывания крови (Aseev et al., 1994); в случае
миодистрофии Дюшенна - иммуноцитохимическим анализом дистро-
фина в биоптатах мышц плода (Hoffman et al., 1992) и т.д.
Следует однако подчеркнуть, что современный уровень молеку-
лярных знаний о природе гена, его мутациях и полиморфизмах
позволяет в идеале проводить молекулярную диагностику наибо-
лее частых моногенных заболеваний, практически, во всех слу-
чаях. Возможности молекулярной диагностики в России пока
весьма ограничены ( Baranov, 1993 ;см. Глава X). Кроме того,
ситуация осложняется сравнительно поздним (часто, уже во
время беременности) обращением семей высокого риска на пре-
натальную диагностику, что не позволяет провести молекуляр-
ные исследования ее информативности в полном обьеме. Связано
это, в первую очередь, с плохой информированностью населения
о работе соответствующих медико-генетических служб.
Из всех существующих способов пренатальной диагностики
методы, основанные на анализе ДНК, являются наиболее точны-
ми, так как они выявляют первичные нарушения в структуре ге-
нов. Это прежде всего относится к тем заболеваниям, диагнос-
тика которых осуществляется путем прямой идентификации му-
тантных аллелей. Тем ни менее, даже в этом случае оконча-
тельное заключение о здоровье будущего ребенка хотя и приб-
лижается к абсолютному, но все же носит вероятностный харак-
тер. Основным источником ошибок при проведении пренатальной
диагностики служит возможная контаминация материала плода,
используемого для постановки диагноза, другими тканями, в
первую очередь, материнского происхождения. Поэтому сразу
после взятия диагностического материала путем биопсии хорио-
на, амниоцентеза или кордоцентеза проводят тщательную его
оценку с использованием разнообразных лабораторных методов.
Отличие молекулярных методов тестирования от биохимических
или любых других заключается в их повышенной чувствительнос-
ти и огромной разрешающей способности. Загрязнение материала
особенно опасно в тех случаях, когда прогноз дается на осно-
ве анализа амплифицированных фрагментов ДНК. Попавшие в тес-
тируемые образцы клетки чужеродного происхождения могут пос-
лужить источником донорской ДНК для ПЦР и тогда может быть
получено несоответствующее действительности заключение о
том, что ребенок будет здоров. Риск подобных ошибок может
быть значительно уменьшен при работе в стерильных условиях и
при постановке анализов в нескольких параллельных пробах.
Конечно, в любом диагностическом центре возможны лаборатор-
ные ошибки чисто технического порядка, не зависящие от ис-
пользуемых методов тестирования. Однако, достоверность прог-
нозирования, основанного на прямом анализе мутантных аллелей
плода, обычно, превышает 99%. При использовании косвенных
методов молекулярной диагностики появляется дополнительный
риск ошибки, связанный с возможностью рекомбинации между му-
тантным аллелем и маркерным локусом (особенно при больших
размерах гена, как, например, в случае гена дистрофина).
Конкретное значение этого риска зависит от взаимного распо-
ложения используемых для диагностики маркеров и соответству-
ющих мутантных аллелей. Обычно, для молекулярной диагностики
используют маркеры, частота рекомбинации которых с мутантны-
ми аллелями гена не превышает десятых, а иногда и сотых до-
лей процента.
В случае неблагоприятного прогноза в отношении здоровья
будущего ребенка решение о прерывании или продолжении бере-
менности принимают родители на основании предоставленного в
их распоряжение общего заключения. После рождения ребенка
или прерывания беременности желательно проводить верификацию
диагноза всеми доступными для этого методами, включая и те,
которые были использованы для постановки пренатального диаг-
ноза.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
При всем разнообразии тем, затронутых в монографии,
весь изложенный в ней материал, по-сути, касается трех
основных проблем : 4(1) 0генетическое картирование и геном че-
ловека, 4(2) 0молекулярная диагностика генных болезней,
4(3)
генокоррекция наследственных дефектов и генотерапия. В реше-
нии каждой из названных проблем достигнуты серьезные успехи.
Напомним некотрые из них.
Известно, что первый ген человека (ген цветной слепо-
ты-дальтонизма) картирован на Х-хромосоме человека в
1911г. Первый аутосомный ген - только в 1968г. К 1973 на
всех хромосомах человека было картировано всего 64 гена, а к
1994г. на генетических картах уже локализовано свыше 60 000
маркерных ДНК последовательностей (главным образом, фрагмен-
тов кДНК экспрессирующихся генов-EST см.Главу III.), а также
4более 05 000 полноразмерных структурных генов. Благодаря мно-
гочисленным полиморфным сайтам и, главным образом, микроса-
теллитным молекулярным маркерам, созданы подробные (1,5-2
сантиморганные) генетические карты для каждой хромосомы че-
ловека. Это позволило перейти от функционального к позицион-
ному картированию, т 4о 0е 4сть 0картированию новых генов
не-
посредственно на физической карте ДНК целого генома.
По мнению авторитетных специалистов по генетическому
картированию таких как Питер Гудфеллоу, Поль Вайссенбах и
др 4угих, 0дальнейшее наращивание плотности молекулярных марке-
ров на хромосомах человека уже лишено смысла, тем более, что
в процессе идетификации все новых и новых генов методом EST,
новые полиморфные сайты все равно будут найдены. Не менее
оптимистично обстоят дела и с секвенированием, т 4о 0е 4сть
0вы-
яснением первичной нуклеотидной последовательности всей
двухметровой молекулы ДНК человека. Достаточно заметить, что
первоначальная стоимость секвенирования одной пары нуклеоти-
дов оценивалась в 1 $, сейчас она составляет уже около 40
центов и продолжает снижается. Причина этого - широкая авто-
матизации монотонного процесса секвенирования. Так, 10 робо-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
