|
клонированных генов с известной нуклеотидной последователь-
ностью полноразмерной кДНК, при этом необходимо предвари-
тельное генотипирование мутантных аллелей у родителей. В
случае прямой диагностики обьектом молекулярного анализа яв-
ляется сам ген, точнее мутации этого гена, идентификация ко-
торых и составляет основную задачу исследования. Такой под-
ход особенно эффективен при наличии точной информации о при-
роде, частоте и локализации наиболее распространенных (доми-
нирующих по частоте) мутаций соответствующих генов, а также
о наличии в них особенно легко мутирующих "горячих" точек. К
таковым относятся мутация delF508 и ряд других мутаций при
муковисцидозе, делеционные мутации при миодистрофии Дюшенна,
мутация R408W при фенилкетонурии, инверсионная мутация при
гемофилии А, протяженная делеция при адрено-генитальном
синдроме, экспансии триплетных повторов в случае "динамичес-
ких" мутаций при синдроме ломкой X-хромосомы и при ряде дру-
гих нейродегенеративных заболеваний (см. Главы IV и X). Ме-
тоды, используемые для направленного поиска этих мутаций,
подробно рассмотрены в Главе IV. В ряде случаев (муковисци-
доз, фенилкетонурия, серповидно-клеточная анемия) эти методы
удалось автоматизировать, что позволяет одноверменно тести-
ровать сразу несколько (до 30 и более) различных мутаций.
При этом появляется реальная возможность выявлять свыше
95-98% мутантных хромосом, что делает целесообразным и эко-
номически оправданным скринирование всей популяции отдельных
стран на выявление мутантных особей для последующей органи-
зации эффективных профилактических мероприятий, направленных
на предупреждение рождения больных детей. Подобные программы
по муковисцидозу уже успешно проводятся в ряде стран Запад-
ной Европы (Великобритания, Дания, Франция) и Северной Аме-
рики.
Главное преимущество прямого метода - это высокая, до-
ходящая до 100%, точность диагностики и отсутствие необходи-
мости анализа всей семьи на предмет её информативности
(см.ниже). Последнее обстоятельство особенно важно для про-
ведения пренатальной диагностики тяжелых, зачастую летальных
наследственных болезней (муковисцидоз, миодистрофия Дюшен-
на, гемофилия А и др). Такие семьи нередко обращаются за ме-
дико-генетической помощью уже после того как больной ребенок
умер. Так, по нашим наблюдениям до 80% семей с высоким рис-
ком муковисцидоза обращаются по поводу необходимости дородо-
вой диагностики уже после смерти больного ребенка (Baranov
et al., 1992).
Однако, существует огромное количество наследственных
болезней, для которых мутации не описаны либо не найдено ма-
жорных мутаций в исследуемых популяциях. И даже во всех тех
случаях, когда имеются мажорные мутации, наряду с ними, опи-
саны многочисленные редко встречающиеся (вплоть до единичных
случаев), так называемые минорные мутации. Кроме того, всег-
да сохраняется возможность присутствия у пробанда неизвест-
ных мутаций, а клонирование гена больного человека для целей
прямого секвенирования, даже ограниченного только смысловой
его частью - кДНК, далеко не всегда возможно в силу очевид-
ных финансовых и временных ограничений такого подхода. Эти
трудности успешно преодолеваются благодаря наличию непрямых
(косвенных) методов молекулярной диагностики.
Этот исторически более ранний подход основан на исполь-
зовании сцепленных с геном полиморфных маркеров, с помощью
которых проводится идентификации мутантных хромосом (точнее
хромосом, несущих мутантный ген) в семьях высокого риска, то
есть у родителей больного и его ближайших родственников. В
настоящее время косвенные методы молекулярной диагностики
принципиально возможны практически для всех моногенных забо-
леваний с известной локализацией контролирующего гена, для
каждого из которых уже разработана удобная система вне- и
внутригенных полиморфных индексных маркеров (см.Главу III).
Более того, косвенные методы молекулярной диагностики
пригодны даже для тех болезней, гены которых еще не иденти-
фицированы и мутации не известны. Единственным и непременным
условием этого является наличие полиморфных сайтов рестрик-
ции либо коротких тандемных повторов типа STR, находящихся в
непосредственной близости от мутантного гена или, что еще
лучше, внутри него (чаще всего в интронах). При помощи этих
полморфных сайтов удается маркировать мутантные аллели гена
и проследить их передачу потомству (см. Главу 111). Ранние
иследования непрямым методом проводились почти исключительно
с использованием полиморфных сайтов рестрикции - двухаллель-
ной системы, информативная емкость которой не превышает 50%,
а реальное число гетерозигот по данному признаку в популя-
ции, зачастую, оказывается существенно ниже 0.5. Следова-
тельно, в лучшем случае только половина гетерозиготных носи-
телей наследственного заболевания, вызванного рецессивной
мутацией какого-нибудь гена, может быть доступна непрямой
молекулярной диагностике с использованием одного полиморфно-
го сайта рестрикции. Повышение информативности в случае
ПДРФ-анализа могло быть достигнуто только путем увеличения
числа полиморфных сайтов. Как првило, для диагностики необ-
ходим не один, а 3-4 полиморфных сайта, что далеко не во
всех случаях возможно. Многие из полиморфных сайтов локали-
зованы вне генов на расстояниях, при которых кроссинговер
может в заметном проценте случаев исказить результаты диаг-
ностики. Кроме того, практическое использование рестрикцион-
ных сайтов зачастую затруднено из-за отсутствия или большой
стоимостью соответствующих эндонуклеазных рестриктаз.
Все эти недостатки могут быть устранены при использова-
нии в качестве молекулярных маркеров высокополиморфных тан-
демно повторяющихся коротких три- и тетрамерных повторов
(STR) (см. Главу III). Для многих генов найдены уникальные
паттерны полиморфных аллелей, отличающихся по числу "коро-
вых" едининц повторяющихся последовательностей нуклеотидов.
Такие "количественные" полиморфизмы , как уже упоминалось
(см.Главу III), очень широко распространены по всему геному
и присутствуют в интронных и фланкирующих областях многих
генов. Появление в конце 1994г 0.7-сантиморганной карты ге-
нома человека, построенной на базе высокополиморфных динук-
леотидных (C-A)n повторов, сделало реальным маркирование,
практически, любого картированного гена. Особенную диагнос-
тическую ценность представляют внутригенные маркеры, для ко-
торых резко снижена вероятность кроссинговера с мутантными
аллелями гена, а следовательно, особенно высока точность ди-
агностики. Кроме того, как оказалось, многие внутригенные
полиморфные короткие тандемные повторы обнаруживают сильное
неравновесие по сцеплению с определенными мутантными аллеля-
ми гена, что значительно облегчает их идентификацию в отяго-
щенных семьях. Индекс гетерозиготности таких полиаллельных
мини- и микросателитных систем нередко превышает 0.8. Их
применение позволяет маркировать, то есть сделать информа-
тивными (см. 7.4) для ДНК-диагностики практически все семьи
высокого риска при условии наличия больного ребенка или дос-
тупности для молекулярного анализа его патанатомического ма-
териала .
Изучение полиморфных маркеров у больного пробанда и его
родителей и выяснение аллельной природы молекулярного марке-
ра, так называемое "определение фазы сцепления" (см.раздел
7.4), составляет основу для дальнейшей диагностики косвенны-
ми методами (Евграфов, Макаров,1987). Применение косвенных
методов молекулярной диагностики предусматривает также в ка-
честве обязательного предварительного этапа исследование
частоты аллелей соответствующих полиморфных сайтов в анали-
зируемых популяциях, среди больных и гетерозиготных носите-
лей мутаций, а также определение вероятности рекомбинации и
неравновесности по сцеплению между маркерными сайтами и му-
тантными аллелями гена. Такие исследования проводятся с по-
мощью методов блот-гибридизации по Саузерну, либо ПЦР
(см.разделы 1.3.; 1.7; 2,5). В первом случае в распоряжении
исследователя должны быть соответствующие ДНК-зонды, во вто-
ром - должны быть известны нуклеотидные последовательности
районов ДНК, включающие соответствующие полиморфные сайты,
для выбора олигопраймеров (см. Главы II,1V).
Раздел 7.2. ДНК-диагностика при различных типах насле-
дования.
Напомним, что значительное число моногенных заболеваний
наследуется по рецессивному типу. Это значит, что при ауто-
сомной локализации соответствующего гена болеют только гомо-
зиготные носители мутаций. Гетерозиготы клинически здоровы,
но с равной вероятностью передают своим детям мутантный или
нормальный варианты гена. Таким образом, на протяжении дли-
тельного времени мутация в скрытом виде может передаваться
из поколения в поколение. При аутосомно-рецессивном типе
наследования в родословных тяжелых больных, которые либо не
доживают до репродуктивного возраста, либо имеют резко сни-
женные потенции к размножению, редко удается выявить больных
родственников, особенно, по восходящей линии. Исключение
составляют семьи с повышенным уровнем инбридинга, который
возникает либо за счет высокой частоты близкородственных
браков, либо за счет вступления в брак людей из одинаковых
изолированных популяций ограниченной численности. Больные
дети с вероятностью 25 % рождаются в тех семьях, где оба ро-
дителя являются гетерозиготными носителями мутаций одного и
того же гена. Возможно также рождение больного ребенка в та-
кой семье, где только один из супругов несет мутацию, а вто-
рая мутация возникла в гамете его партнера в момент, пред-
шествующий оплодотворению. Доля таких семей в общей группе
риска относительно невелика, а риск повторного рождения в
них больного ребенка не превышает общей частоты спонтанного
возникновения мутаций в данном гене. Для болезней, сцеплен-
ных с полом, то есть контролируемых генами, локализоваными в
Х-хромосоме, характерно то, что болеют преимущественно маль-
чики, тогда как носителями являются девочки.
Y-хромосома содержит очень мало генов, большинство из
которых (около 10) картировано в так называемой псевдоауто-
сомной области короткого плеча, гомологичной таковой на ко-
ротком плече X-хромосомы. Важнейшим истинным геном Y-хромо-
сомы, то есть геном, представленным только на этой хромосо-
ме, является ген SRY (Yp21.1), детерминирующий развитие пола
по мужскому типу. Мутации этого регуляторного гена приводят
к нарушениям половой дифференцировки (XY-женщины), а его пе-
ренос вследствие ошибок рекомбинации псевдоаутосомных райо-
нов на короткое плечо X-хромосомы обусловливает синдром ре-
версии пола- Sex reverse (XX-мужчины) (McElreavey et al.,
1993). Практически важно, что присутствие даже небольшого
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
