|
лиз полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так назы-
ваемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism
-RFLP analysis), включает следующие этапы: выделение геном-
ной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекро-
форетическое разделение образующихся фрагментов ДНК и иден-
тификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рест-
рикции, путем блот-гибридизации по Саузерну (см.Главу 1).
При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофо-
реграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения
ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соот-
ветствующий по длине последовательности ДНК между двумя
соседними константными сайтами рестрикции для той же эндо-
нуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на
электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам
фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рест-
рикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции. С
каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному
локусу, будет происходить гибридизация зависит от локализа-
ции используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае
возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рест-
рикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплемен-
тарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рест-
рикци. Однако, такие зонды очень редко используются на прак-
тике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в
десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда уда-
ется выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий по-
лиморфный сайт рестрикции. Поэтому в дальнейшем для простоты
изложения мы будем рассматривать только более общую ситуацию
и считать, что при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте
ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при на-
личии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую дли-
ну. Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосо-
мах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной об-
ласти, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в
нижней области геля, соответствующий более короткому фраг-
менту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей по-
лиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в
верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины,
тогда как у гетерозигот проявятся оба эти бэнда (Рис. 2.3а).
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае,
если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содер-
жащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния
этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амп-
лифицированного фрагмента. При отсутствии сайта узнавания в
исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента
не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеа-
зой, тогда как при полном соответствии полиморфной области
сайту рестрикции образуются два фрагмента меньшей длины
(Рис.2.3б). У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента,
один из которых по длине будет соответствовать размеру амп-
лификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же
суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использова-
ния для анализа блот гибридизации по Саузерну, трем возмож-
ным вариантам генотипа будут соответствовать три различных
варианта электрофореграмм.
Необходимо подчеркнуть, что первичная идентификация по-
лиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными ге-
нами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зон-
дов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной
нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этой целью используют
широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выде-
ленной из группы неродственных индивидуумов, представляющих
собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят
ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором име-
ющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из
популяций аналогичные исследования проводят в других популя-
циях.
Следует учитывать, что полиморфные сайты рестрикции
всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому да-
же при самой высокой вариабильности такого сайта, число ге-
терозиготных по данному локусу особей в популяции не будет
превышать 50% Между тем, только при наличии полиморфного
сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный
аллель от нормального, то есть осуществить его молекулярную
маркировку. Следовательно, информационная емкость такого по-
лиморфизма относительно невелика ( см. Главы Y и VII).
Раздел 2.6 Вариабильные микро- и минисателлитные ДНК.
Гипервариабильные сателлитные повторы являются гораздо
более информтивными маркерами по сравнению с полиморфными
сайтами рестрикции, так как представляют собой мультиаллель-
ные системы с уровнем гетерозиготности, достигающим 70 -
90%. Кроме того, оказалось, что количество высокоизменчивых
микрои минисателлитных последовательностей в геноме челове-
ка, по-видимому, превышает несколько десятков тысяч, они
достаточно плотно и равномерно расположены в каждой из хро-
мосом. Так более 90% из 5000 идентифицированных (C-A)-повто-
ров являются полиморфными, причем в большинстве из них уро-
вень гетерозиготности значительно превышает 50% (Weissenbach
et al, 1992). Среди гипервариабильных мини-сателлитных
последовательностей различают варьирующие по числу тандемные
повторы - VNTR, три-, тетра- и пентануклеотидные повторы, а
также некоторые другие классы повторов. Общее число высоко-
полиморфных минисателлитных последовательностей в геноме
превышает 1500 (Armour et al., 1990; Charlesworth et al.,
1994). VNTR (variable number tandem repeats - варьирующие по
числу тандемные повторы) -характеризуются наличием 10 - 15 -
ти нуклеотидных "коровых" последовательностей, сходных с
контролирующими элементами рекомбинации E.coli (Jeffreys et
al., 1985). С помощью ДНК-зондов, сконструированных на осно-
ве тандемно повторяющихся "коровых" последовательностей,
можно анализировать индивидуальную изменчивость в единичных
или множественных высокополиморфных локусах, несущих одно-
типную коровую последовательность. Примером может служить
VNTR, обнаруженная в интроне миоглобинового гена, включающая
четыре тандемных повтора из 33 п.о., фланкированных прямыми
повторами из 9 п.о. Полученные из этого района ДНК-зонды с
успехом используются для идентификации личности методом
ДНК-фингерпринта, так как вероятность совпадения аллелей у
двух неродственных индивидуумов по всем гипервариабильным
локусам, гибридизующихися с этим ДНК-зондом, значительно
меньше 10!-7 (Jeffreys et al.,1991). Высокополиморфные VNTR
найдены также в гене инсулина, в области глобинового псевдо-
гена и в Х-хромосоме, содержащей последовательности, гомоло-
гичные ДНК вируса гепатита В (Nakamura et al., 1985). В
последнее время многочисленные VNTR- последовательности об-
наружены в хромосомах 1, 2q, 14, 16, 17, 19 (O'Brien,1992).
Поиск новых гипервариабильных локусов основан на системати-
ческом скрининге клонированных последовательностей ДНК с по-
мощью искусственно синтезированных "коровых" зондов. Особен-
но удобны для такого скрининга геномные библиотеки,
сконструированные на основе предварительно фракционированных
по величине Mbo1 или Sau3A1 фрагментов ДНК, так как большие
фрагменты обогащены длинными и более вариабильными минисате-
литными последовательностями (Armour, et al., 1990). Хорошие
результаты были получены также при скринировании космидных
библиотек с помощью G-богатых синтетических ДНК-зондов и
использование хемолюминесцентного метода в сочетании с ПЦР
(Decorte, Cassiman, 1990). В некоторых случаях с этой целью
применяют также последовательности ДНК, выделенные из фага
М13, имеющего в своем составе сходные структуры (Armour
etal., 1990).
Одним из вариантов минисателлитных последовательностей
являются тримерные и тетрамерные короткие тандемные повторы
-STR (short tandem repeats), которые стабильно наследуются и
также обладают высоким уровнем полиморфизма по числу коровых
единиц (Edwards et al., 1991). В X хромосоме такие повторы
обнаружены через каждые 300 - 500 кб, тогда как в других
частях генома они встречаются на расстоянии 10 кб друг от
друга. По некоторым оценкам их частота может достигать 1/20
кб (Charlesworth et al.,1994). Возможно, истиное число три-
и тетрамерных повторов в геноме человека еще больше, так как
они обнаружены во многих генах. Подобно другим повторам STR
обычно встречаются в некодирующих частях генов. В последнее
время, однако, обнаружена группа структурных генов, несущих
тримерные повторы в регуляторных и даже в транслируемых
частях генов. Изменения числа этих внутригенных повторов в
сторону их увеличения может приводить к нарушению функции
этих генов вплоть до полного блока экспрессии и быть причи-
ной ряда тяжелых наследственных заболеваний - болезни
экспансии (см.Главу X). В качестве зондов для выявления ко-
ротких тандемных повторов используют синтетические олигонук-
леотиды, построенные из простых повторов трех или четырех
нуклеотидов.
В последнее время для обнаружения различных классов
микросателлитных последовательностей и STR-повторов применя-
ют эффективные методы, основанные на использовании ПЦР
(Edwards et al., 1991). Для этих локусов характерно большое
число аллелей, которые различаются по числу коровых единиц.
Продукты амплификации этих сайтов могут отличаться друг от
друга числом ди- три- или тетрануклеотидных повторов. Для
удобства идентификации различных аллелей полимеразную цепную
реакцию проводят в присутствии меченых нуклеотидов, а для
электрофоретического разделения продуктов амплификации
используют специальные секвенирующие гели. Многие STR-локусы
настолько полиморфны, что нашли применение в судебной меди-
цине для идентификации личности. Для повышения достоверности
результатов с этой целью используют мультиплексные варианты
ПЦР, позволяющие устанавливать генотип индивидуума одновре-
менно по нескольким STR-сайтам (Weber,May, 1994; Асеев и
др.,1995). Возможность точного генотипирования личности с
использованием полимеразной цепной реакции, то есть на мини-
мальном количестве ДНК, является важным методическим преиму-
ществом STR перед ранее рассмотренными VNTR, для анализа ко-
торых чаще используют блот-гибридизацию по Саузерну.
Высокая частота коротких тандемных повторов, уникаль-
ность комбинаций числа тетра-, три- и димеров в разных сай-
тах в сочетании с их большой вариабильностью и сравнительной
легкостью идентификации аллелей позволяет широко использо-
вать эти повторы для генетического и физического картирова-
ния в качестве наиболее удобных индексных маркеров геномных
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
