|
одних и тех же типах тканей, тогда как в процессе онтогене-
тической дифференцировки происходят значительные изменения
рисунков метилирования. В перевиваемых культурах клеток опу-
холевого происхождения число метилированных сайтов резко
уменьшено.
Высказано предположение о наличии прямой связи между
метилированием ДНК и состоянием генетической активности в
клетках. Существует класс белков, которые специфическим об-
разом связываются с метилированными участками ДНК, делая их
недоступными для действия ряда ферментов, в том числе, воз-
можно, и для полимераз. Получено много прямых эксперимен-
тальных доказательств роли метилирования ДНК в инактивации
эукариотических промоторов, а, значит, и в регуляции актив-
ности генов. Напротив, гипометилирование промоторной области
генов, в особенности CpG островков, как правило, свиде-
тельствует о функциональной активности генов. Показано, что
необычные структуры в молекуле ДНК, также как экзогенная
ДНК, инкорпорированная в процессе генетической трансформа-
ции, нередко подвергаются метилированию. Известно, что мети-
лирование играет важную роль в инактивации X хромосомы у са-
мок, в регуляции экспрессии генов в процессе развития, а
также непосредственно вовлечено в феномен хромосомного (ге-
номного) импринтинга, связанного с различиями пенетрантности
некоторых аллелей в зависимости от их происхождения, то есть
прохождения через материнский или отцовский гаметогенез (Ба-
ранов, 1991).
В GC-богатых изохорах локализовано большое количество
CpG островков - последовательностей от 500 до 2000 п.о., ха-
рактеризующихся очень высоким содержанием гуанина и цитозина
(G+C > 60%), представленных в виде кластеров неметилирован-
ных CpG дуплетов и, так называемых, G/C боксов - локусов,
родственных сайту узнавания для одного из транскрипционных
факторов Sp1 - (G)4C(G)4C (Lindsay, Bird, 1987; Bird, 1986;
Aissani, Bernardi, 1991). CpG острова содержат много сайтов
узнавания для чувствительной к метилированию эндонуклеазы
HpaII, а также сайты для редкощепящих рестриктаз, узнающих
неметилированные CpG дуплеты. В частности, более 80%
Nor1-сайтов связано с CpG-богатыми островками. Как правило,
CpG островки локализованы в 5'- фланкирующих последователь-
ностях, 5'-зкзонах и 5'-интронах всех изученных хаузки-
пинг-генов и 40% тканеспецифических генов. CpG островки яв-
ляются характерной особенностью транскрибируемых участков
генома. Их идентификация в клонированных последовательностях
геномных библиотек существенно облегчает поиск конкретных
структурных генов (см.раздел 2.4) . Наибольшая плотность CpG
островков наблюдается в теломерных участках хромосом 1, 9,
15, 16, 17, 19, 20, 22 (Antonarakis,1994). Точные молекуляр-
ные методы регистрации СрG островков показали, что их число
в геноме человека приближается к 45000 (
Antequera,Bird,1993).
Можно также отметить существование в геноме человека
сайтов, гиперчувствительных к действию ДНК-азы 1 и структур-
но отличающихся от основной массы хроматина. Присутствие та-
ких сайтов показано для многих генов млекопитающих и, по-ви-
димому, это необходимое, но не достаточное условие их
экспрессии. Локализация гиперчувствительных сайтов может ме-
няться в процессе развития и под действием гормонов. В неко-
торых случаях эти участки маркируют положение транскрипцион-
ных регуляторных элементов генома, действующих как в положи-
тельном, так и в отрицательном направлениях. В других случа-
ях это области функционально активных генов, находящихся в
деспирализованном состоянии и имеющих однонитевую структуру.
Именно такие однонитевые участки ДНК особенно выско чувстви-
тельны к ДНК-азе 1. На этом их свойстве основан метод
ник-трансляции in situ, позволяющий непосредственно на хро-
мосомных препаратах визуализировать функционально активные
районы хромосом. С этой целью хромосомные препараты обраба-
тывают ДНК-азой 1, после чего непосредственно на них с по-
мощью ДНК-полимеразы проводят синтез ДНК в присутствии мече-
ных нуклеотидов. При этом метка включается преимущественно
только в те участки хромосом,где находятся функционально ак-
тивные гены (Verma, Babu, 1989).
ГЛАВА II.
ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА, СТРУКТУРА ГЕНОВ.
Раздел 2.1. Определение генома и его основных элемен-
тов.
Термин геном используется для обозначения полной гене-
тической системы клетки, определяющей характер онтогенети-
ческого развития организма и наследственную передачу в ряду
поколений всех его структурных и функциональных признаков.
Понятие генома может быть применено к таксономической груп-
пе, виду, отдельной особи, клетке, микроорганизму или ви-
русу. Так, можно говорить о структуре генома эукариот и про-
кариот, сравнивать геномы разных видов, изучать особенности
строения генома у конкретных индивидуумов или следить за из-
менениями, происходящими в геноме специфических клеток в
процессе их онтогенетической дифференцировки. Часто геном
определяется как генетическая информация, заключенная в мо-
лекулах ДНК одной клетки. Однако, такие факты, как
отсутствие связи между количеством ДНК в расчете на гаплоид-
ный геном и таксономическим статусом видов, а также много-
численные примеры существования огромных различий в содержа-
нии ДНК между близкородственными видами (так называемый
"С-парадокс") свидетельствуют о том, что далеко не все
участки ДНК связаны с информационными функциями. Понятия ге-
нома и ДНК в значительной степени тождественны, так как
основные принципы организации и функционирования генома це-
ликом определяются свойствами ДНК. Присущие этим молекулам
потенциальные возможности практически неограниченного струк-
турного разнообразия определяют все многообразие мира живых
существ, как на уровне межвидовых, так и индивидуальных раз-
личий в пределах одного вида (Баев и др.,1990; Ратнер,1985).
Процесс эволюции и дифференцировки отдельных видов, как
правило, сопровождался накоплением изменений в структуре ге-
нома. Это касается, прежде всего, таких параметров, как ло-
кализация и характер упаковки ДНК в клетках; количество ДНК,
приходящееся на гаплоидный геном; типы, соотношение и функ-
ции кодирующих и некодирующих нуклеотидных последователь-
ностей; регуляция экспрессии генов; межпопуляционная вариа-
бильность и филогенетический консерватизм первичной структу-
ры генома. В пределах одного вида основные параметры генома
достаточно постоянны, а внутривидовое разнообразие обеспечи-
вается за счет мутационной изменчивости, то есть выпадения,
вставки или замены нуклеотидов на сравнительно небольших
участках ДНК. Чаще всего такие изменения касаются не-
экспрессируемых элементов генома (интронов, псевдогенов,
межгенных спэйсерных участков ДНК и т.д.).
Геномы эукариот, по-существу, можно рассматривать как
мультигеномные симбиотческие конструкции, состоящие из обли-
гатных и факультативных элементов (Golubovsky, 1995). Основу
облигатных элементов составляют структурные локусы, коли-
чество и расположение которых в геноме достаточно постоянно.
Присутствие в хромосомах некоторых видов повторяющихся ДНК,
амплифицированных участков, ретровирусных последователь-
ностей, псевдогенов, также как наличие в клетке эписом, рет-
ротранскриптов, ампликонов, дополнительных B-хромосом и раз-
личных цитосимбионтов (вирусов, бактерий, простейших) явля-
ется не строго обязательным, их количество и положение может
значительно варьировать, то есть эти элементы являются фа-
культативными. В то же время участие факультативных элемен-
тов в наследственной передаче признаков, в формировании му-
тационной изменчивости и в эволюционных преобразованиях ви-
дов несомненно доказано. Кроме того, существует непрерывный
переход от одних состояний к другим за счет инсерции
экстрахромосомных ДНК в хромосомы и выстраивания транспозо-
ноподобных мобильных элементов из хромосом. Следовательно,
несмотря на значительные отличия факультативных последова-
тельностей от облигатных по характеру основных информацион-
ных процессов (репликации, транскрипции, трансляции и сегре-
гации), они также должны рассматриваться, как важнейшие эле-
менты генома.
Остановимся теперь более детально на основных принципах
организации генома человека. В каждой диплоидной клетке с 46
хромосомами содержится около 6 пикограмм ДНК, а общая длина
гаплоидного набора из 23 хромосом составляет 3.5 * 10!9 пар
нуклеотидов (Kao, 1985). Этого количества ДНК достаточно для
кодирования нескольких миллионов генов. Однако, по многим
независимым оценкам истиное число структурных генов нахо-
дится в пределах от 50 000 до 100 000. В разделе 2.4 изложе-
ны современные подходы, используемые для подсчета общего ко-
личества генов, из которых следует, что наиболее вероятная
оценка их числа составляет около 80 000. Сопоставляя это
значение со средними размерами гена и соотношением между ве-
личиной их экзонных и интронных областей, можно заклю-
чить,что кодирующие последовательности ДНК занимают не более
10-15% всего генома (McKusick, Ruddle, 1977). Таким образом,
основная часть молекул ДНК не несет информации об амино-
кислотной последовательности белков, составляющих основу лю-
бого живого организма, и не кодирует структуру рибосомаль-
ных, транспортных, ядерных и других типов РНК. Функции этой
"избыточной" (junk) ДНК не ясны, хотя ее структура изучена
достаточно подробно. Предполагается, что эта ДНК может
участвовать в регуляции экспрессии генов и в процессинге
РНК, выполнять структурные функции, повышать точность гомо-
логичного спаривания и рекомбинации, способствовать успешной
репликации ДНК и, возможно, является носителем принципиально
иного генетического кода с неизвестной функцией.
Наиболее общая характеристика генома может быть получена
с помощью анализа кинетики реассоциации молекул ДНК. Динами-
ка плавления геномной ДНК обнаруживает присутствие по край-
ней мере трех различающихся по химической сложности фракций
(Льюин, 1987; Газарян, Тарантул, 1983). Быстро ренатурирую-
щая фракция ДНК состоит из относительно коротких высокопов-
торяющихся последовательностей; в промежуточную фракцию вхо-
дит множество умеренно повторяющихся ДНК - более протяжен-
ных, но представленных меньшим числом копий; медленно рена-
турирующая фракция объединяет в себе уникальные последова-
тельности ДНК, встречающиеся в геноме не более 1-2 раз.
С помощью молекулярного анализа проведена идентификация
основных классов повторяющихся последовательностей ДНК,
составляющих более 35% всего генома человека и включающих
сателлитную ДНК, инвертированные повторы, умеренные и низко-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
