|
моногенное заболевание (частота 1: 6 000 новорожденных).
СМА подразделяется на три клинические формы. Тип I. Острая
форма (болезнь Верднига-Гоффмана), проявляется в первые 6 ме-
сяцев жизни и приводит к смерти уже в первые два года; Тип
II. Средняя (промежуточная) форма, пациенты не могут стоять,
но обычно живут более 4-х лет; Тип III. Ювенильная форма
(болезнь Кугельберга-Веландера) - прогрессирующая мышечная
слабость после 2-х лет. Все три формы представляют собой ал-
лельные варианты мутаций одного гена SMN (survival motor
neurons), картированного в локусе D5S125 (5q13) и идентифи-
цированного методом позиционного клонирования (см.Главу III)
в 1995г (Lefebvre et al. 1995). В этой пока единственой ра-
боте показано, что ген SMN размером всего 20 000 п.о.состоит
из 8 экзонов. мРНК этого гена содержит 1 700 п.о. и кодирует
ранее неизвестный белок из 294 аминокислотных остатков с
молекулярным весом 32 КилоДальтона.
Ген дуплицирован. Его копия (возможно вариант псевдоге-
на) располагается несколько ближе к центромере и отличается
от гена SMN наличием 5-и точечных мутаций, позволяющих отли-
чить оба гена путем амплификации экзонов 7 и 8 и их исследо-
ванием методом SSCP анализа (см.Главу IV). Ген назван
сBCD541, по аналогии с первоначальным вариантом названия для
теломерной копии, т 4о 0е 4сть 0гена SMN, tBCD541. Ген
cBCD541
экспрессируется, но в отличие от гена SMN его сДНК подверга-
ется альтернативному сплайсингу с утратой экзона 7.
Отсутствие гена SMN (tBCD541) у 93% больных (213 из 229),
его разорванная (interrupted) структура у 13 обследованных
пациентов (5.6%) и наличие серьезных мутаций у оставшихся
3-х больных дали основание именно данную теломерную копию
гена считать ответственной за заболевание. Существенно отме-
тить, что центромерная копия гена обнаружена у 95 4. 05% боль-
ных, 4тогд 0а 4как 0 отсутств 4ует она 0 только у 4,4% 4
пациентов 0.
В непосредственной близости от теломерного конца гена
SMN идентифицирован еще один ген - ген белка-ингибитора зап-
рогаммированной гибели нейронов (neuronal apoptosis
inhibitory protein -NAIP). При тяжелых клинических формах
СМА (Тип I), обусловленных делециями, по-видимому, нередко
происходит утрата гена NAIP.
Согласно гипотезе авторов СМА возникает при гомозигот-
ном состоянии мутаций (обычно-делеций) в гене SMN, 4при этом
различ 4ия между 0форм 4ами 0СМА определяются двумя основными
фак-
торами: 1. числом копий гена cBCD541 (две - в случае Типа I
и четыре (возникающих вследствие конверсии между SMN и
cBCD541) - в случае Типа III), 2. наличием или отсутствием
ген 4а 0NAIP. 4С 0реди всех обследованных СМА-больных
4не
4обнаружены 0случа 4и одновременной 0делеции обоих
гомологичных
генов 4- 0SMN (tBCD541) и сBCD541 4, что 0указывает, по
мнению
авторов, 4на то, 0что такая аберрация должна проявляться как
доминантная леталь еще в эмбриогенезе.
Некоторые положения этой, безусловно, основополагающей
работы французских авторов, по-видимому, еще требуют уточне-
ния, однако, уже сейчас она сделала возможной прямую молеку-
лярную диагностику СМА у 98,6% больных. С этой целью прово-
дится амплификация экона 7, который отсутствует у подавляю-
щего большинства больных. Нормальный экзон 7 (ген SMN) диф-
ференцируют от мутантного варианта (ген cBCD541) c помощью
SSCP анализа. При необходимости возможна косвенная диаг-
ностика - ПЦР анализ динуклеотидных (CA) повторов ДНК ло-
кусов D5S125; D5S112; D5S127; ПДРФ-анализ с фланкирующими
ДНК-зондами MU, 105-153RA; 153-6741 GT.
10.4.11 Атаксия Фридрейха.
Атаксия Фридрейха (АФ) - сравнительно редкое (1 : 22
-25 000) аутосомно-рецессивное заболевание, характеризующе-
еся прогрессивной дегенерацией нервных клеток мозжечка. Ген
АФ не идентифицирован, но достаточно точно картирован на
хромосомных (9q13-q21) и физических картах ДНК-маркеров. На-
иболее тесное сцепление гена АФ показано для локуса D9S5
(зонд 26Р). Сконструированы космидные библиотеки и
составлены подробные физические карты области 4 0геномной ДНК
хромосомы 9, включающей локус D9S7 и, предположительно, ген
АФ. Определено положение гена ФА по отношению к другим флан-
кирующим молекулярным маркерам (Fujita etal., 1991; Wilkes
et al., 1991) 4. 0В настоящее время известно, по крайней мере,
5 таких ДНК маркеров: GS4, MCT-112, GS2 -дистальные и мик-
росателлитные маркеры FD1 (на расстоянии 80 кб 4) 0и MLS1 (на
расстоянии 150 кб) - проксимальные. Изучены особенности ал-
лельного полиморфизма этих систем для различных популяций
Западной Европы. Для всех 5 молекулярных маркеров выяснены
гаплотипы, сцепленные с заболеванием. Гаплотипы обоих мик-
росателлитных маркеров оказались в абсолютном генетическом
неравновесии с АФ, что доказывет их весьма близкое располо-
жение на генетической карте по отношению к мутантному гену
АФ (Pianese et al., 1994).
Диагностика АФ пока возможна только непрямыми методами.
ПДРФ анализ с помощью ДНК-зондов на дистальные полиморфные
сайты, либо ПЦР анализ полиморфизма проксимальных по отноше-
нию к гену АФ микросателлитных маркеров MLS1 или FD1.
Нами рассмотрены лишь некоторые моногенные наследствен-
ные болезни, условно разделенные на три подгруппы, исходя,
главным образом, из того насколько они изучены с молекулярно
-генетических позиций, их актуальности для пренатальной ди-
агностики и в какой мере они важны для медико-генетической
службы нашей страны. Более того, исторически сложилось так,
что именно такие заболевания как муковисцидоз, миодистрофия
Дюшенна, гемофилия А, фенилкетонурия, то 4 0есть 4 0социально
наи-
более значимые, раньше других генных болезней стали предме-
том детального молекулярного анализа в нашей лаборатории и в
других медико-генетических центрах и научно-практических
подразделениях России (см. Баранов, 1991, 1994;
Baranov,1993; Евграфов, Макаров, 1987).
Естественно, что рассмотренными нозологиями отнюдь не
исчерпывается список тех болезней, которые являются объекта-
ми молекулярных исследований в нашей стране. Например, из
обзора выпали такие моногенные 4 0болезни как гиперхолестерине-
мия, гемоглобинопатии, дефицит альфа-1 антитрипсина, мито-
хондриальные болезни. 4 0Для многих из них разработаны и широко
применяются эффективные методы молекулярной диагностики, ве-
дутся исследования по генотерапии. 4 0Мы не касались также ра-
бот проводимых, 4 0главным образом, 4 0в возглавляемой
профессором
Е.И.Шварцем лаборатории молекулярной диагностики ПИЯФ РАН и
посвященных молекулярному анализу мультифакториальных забо-
леваний, 4 0таких как диабет, гипертония, ишемия сердца. Ре-
зультаты этих 4 0исследований 4 0будут, по-видимому,
предметом
следующих обзоров и монографий.
ГЛАВА I
СТРУКТУРА И МЕТОДЫ АНАЛИЗА ДНК.
Раздел 1.1 Общие представления, центральная догма, гене-
тический код.
Универсальная генетическая субстанция или "энциклопедия
жизни", ДНК, содержит информацию, необходимую для синтеза
белков и нуклеиновых кислот, присутствующих во всех типах
клеток как про- так и эукариот. Дезоксирибонуклеиновые кис-
лоты (ДНК) - это нитевидные молекулы, состоящие из четырех
расположенных в варьирующем порядке нуклеотидов: пуринов -
аденина и гуанина, и пиримидинов - цитозина и тимина, соеди-
ненных в полинуклеотидную цепь с остовом из чередующихся ос-
татков сахара - дезоксирибозы, и фосфата. Последовательность
нуклеотидов ДНК или пар оснований составляет информационную
емкость молекулы, определяя порядок синтеза и аминокислотную
последовательность белков в соответствии с универсальным для
всех живых существ трехбуквенным - триплетным, генетическим
кодом (Табл.1.1). Дезоксирибонуклеиновые кислоты представля-
ют собой единственный тип молекул, способных к самовоспроиз-
водству или репликации, что и обеспечивает преемственность
генетической информации в ряду поколений. Записывается
последовательность ДНК слева направо (5' - 3') первыми заг-
лавными буквами соответствующих нуклеотидов, являющихся од-
новременно единицами измерения молекулы. Размеры ДНК могут
меняться в гигантских пределах от нескольких нуклеотидов до
миллиардов пар оснований (п.о.). В качестве единиц измерения
размеров ДНК используются также килобазы (kb) и мегабазы
(mb) - последовательности, соответствующие тысячи и миллиону
пар оснований, соответственно.
ДНК могут существовать как в виде однонитевых, так и в
виде двухнитевых молекул. Двухнитевые или двухцепочечные мо-
лекулы образуются за счет химического комплементарного спа-
ривания между аденином и тимином (А - Т) и между гуанином и
цитозином (Г - Ц). Эти водородные связи между парами нуклео-
тидов достаточно непрочные, так что цепи ДНК могут легко
диссоциировать - разделяться, и ассоциировать - соединяться,
при изменении температуры или солевых концентраций. При каж-
дом цикле ассоциаци - диссоциации или, как еще говорят, от-
жиге - плавлении, будет точно воспроизводиться двухнитевая
структура - дуплекс, устойчивость которого определяется со-
ответствием нуклеотидных пар. Наиболее устойчивы структуры,
представленные полностью комплементарными нитями ДНК. Про-
цесс образования дуплексов носит название гибридизации. Спо-
собность к комплементарному спариванию оснований - одно из
самых замечательных свойств ДНК, определяющих возможность ее
саморепликации и точного выбора специфических участков акти-
вации молекулы в процессе считывания генетической информа-
ции. Это свойтво широко используется в молекулярной биологии
для поиска и идентификации нужных последовательностей в ог-
ромных молекулах ДНК при использовании в качестве зондов ее
сравнительно небольших меченых фрагментов.
У человека большая часть ДНК- 3.2 миллиарда пар основа-
ний, находится в ядрах клеток в виде 46 плотно упакованных,
суперскрученных за счет взаимодействий с ядерными белками
структур, называемых хромосомами. Сравнительно небольшая
часть ДНК - около 5%, пристствует в митохондриях - органел-
лах цитоплазмы, обеспечивающих процессы дыхания и энерегети-
ческого обмена клеток эукариот. В большинстве соматических
клеток ДНК представлена в двух копиях - по одной в каждой
хромосоме. Таким образом, в клетках присутствуют 23 пары
хромосом, 22 из которых гомологичны друг другу - аутосомы, и
одна пара (X и Y) - половые хромосомы. Наличие Y хромосомы
определяет мужской пол особи. При записи нормального карио-
типа индивидуума указывается общее число хромосом и тип по-
ловых хромосом. Таким образом, нормальный кариотип мужчины -
46,XY, а женщины -46,XX. В процессе гаметогенеза происходит
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
