|
al.,1994).
По своему функциональному назначению гены могут быть
разделены на две группы. Группа I представлена генами, коди-
рующими собственно белки; группа II - генами, контролирующи-
ми синтез рибосомальных, транспортных и ядерных РНК. По ха-
рактеру экспрессии гены также могут быть подразделены на две
группы - гены "домашнего хозяйства" (housekeeping genes),
продукты которых необходимы для обеспечения жизнедеятель-
ности любого типа клеток, и тканеспецифические гены, обеспе-
чивающие специализированные функции клеток, то есть гены,
функционально активные только в определенных типах клеток
(тканей) и только на определенных стадиях онтогенеза, так
называемые гены терминальной дифференцировки.
Считается, что средние размеры гена человека составля-
ют, примерно, от 10 до 30 кб. Однако, эта величина может ко-
лебаться от нескольких десятков до миллионов пар нуклеоти-
дов. Согласно последним данным, самый маленький из известных
генов- МСС-7, имеет размеры всего 21 п.о. (Gonzales-Pastor
et al.,1994), а самый болшой - ген дистрофина -2.2 мегабаз.
Гены отделены друг от друга протяженными промежутками -
спейсерами, содержащими в своем составе большое количество
повторяющихся последовательностей ДНК и нетранскрибируемые
уникальные последовательности.
Рассмотрим более подробно современные данные о числе
генов в геноме человека. Полученные разными методами оценки
этой величены приведены в Табл.2.1. Исходя из размера генома
(около 3 000 миллионов п.о.), и среднего размера одного гена
порядка 10 - 30 тыс.п.о. (Gilbert, 1992), общее число генов
должно быть порядка 100 000. При этом, как уже указывалось,
распределение генов на хромосомах крайне неравномерно. Уста-
новлено, что более 90% генов находится в Гимза -отрицатель-
ных районах метафазных хромосом, в так называемых R-бэндах
(Antequera,Bird ,1993). Проведенные недавно прямые исследо-
вания методом секвенирования показывают, что в R-бэндах их
число достигает 43-50 на один бэнд, а в Гимза- положительных
районах хромосом (G бэндах), - только 1-2 на 75-80 килобаз,
то есть всего в геноме можно ожидать около 70 000 генов.
Оценка числа генов по доле транскрибируемой части генома
(всего 12%) дает совсем маленькую величину - 20 000 генов
(Wagner et al.,1993). Методом исследования кинетики реассо-
циации РНК в культуре клеток число генов оценивается между
20 - 40 000 (Lewin, 1990). В то же время в клетках мозга
число различных мРНК по некоторым данным достигает 97 000
(Wagner et al.,1993). Наиболее точные подсчеты числа генов
человека проведены в последнее время и основаны на оценке
числа CpG островков (Табл.2.1). Известно, что в промоторной
области всех генов "домашнего хозяйства" и примерно у 40 %
генов терминальной дифференцировки, обеспечивающих специали-
зированные функции дифференцированных клеток, находятся об-
ласти коротких динуклеотидных CpG повторов. Разработаны мо-
лекулярные методы точной регистрации этих участков, которые
показали, что их число в геноме около 45 000, отсюда число
структурных генов оценивается в 67-70 000 ( Antequera, Bird,
1993). Практически такое же число генов (64 000) определено
недавно методом учета маркерных экспрессирующихся последова-
тельностей (expressed sequence tags) (Fields et al., 1994).
Таким образом, суммируя вышеизложенное, можно сделать вывод,
что в геноме человека содержится, в среднем, около 70-80 000
отдельных транскрибируемых ДНК последовательностей, то есть
генов.
Транскрипция гена начинается с 5' конца первого экзона,
где расположен сайт инициации транскрипциии. Определенной
гомологии между стартовыми сайтами разных генов не наблюда-
ется, но чаще всего они начинаются с нуклеотида А, окружен-
ного пиримидиновыми основаниями. На границах между экзонами
и интронами имеются консервативные канонические последова-
тельности, играющие существенную роль в обеспечении точности
вырезания интронов во время сплайсинга РНК. Все интронные
последовательности начинаются с динуклеотида GT и заканчива-
ются динуклеотидом AG, называемыми, соответственно, донорны-
ми и акцепторными сайтами сплайсинга. На 3' конце многих
структурных генов идентифицирована поли(А)-сигнальная после-
довательность (AATAAA), участвующая в процессе модификации
первичного РНК транскрипта и ответственная за альтернативный
сплайсинг мРНК, обеспечивающий синтез разных зрелых мРНК с
одного и того же первичного РНК транскрипта.
Транскрипция генов осуществляется с помощью фермента
РНК-полимеразы. Около 50-70% клеточного синтеза РНК обеспе-
чивается РНК-полимеразой I, локализованной в ядрышках и от-
ветственной за синтез генов рибосомальной РНК. РНК-полимера-
за II обеспечивает транскрипцию генов, кодирующих собственно
структурные белки. Этот фермент локализован в ядре (но не в
ядрышках). На его долю приходится 20 - 40% синтеза РНК.
РНК-полимераза III контролирует синтез ядерных и транспорт-
ных РНК (Льюин, 1987). На 1-м этапе РНК-полимераза связыва-
ется с двухнитевым участком ДНК и, расплетая его, делает
доступным спаривание смысловой нити ДНК с рибонуклеотидами
(Рис. 2.2). После того как первый нуклеотид РНК инкорпориру-
ется в сайт инициации транскрипции, полимераза начинает
продвигаться по нити ДНК в направлении 5'- 3', расплетая
двойные нити ДНК впереди себя и заплетая их позади. Этот
процесс продолжается до достижения терминирующего сигнала,
представляющего собой один или несколько терминирующих кодо-
нов. Затем молекулы РНК и фермента высвобождаются и двойная
спираль (дуплекс) ДНК полностью восстанавливается.
Для правильного начала синтеза РНК необходимо точное
взаимодействие РНК-полимеразы с молекулой ДНК. Этот процесс
контролируется промотором - специальной регуляторной после-
довательностью ДНК размерами около 75 п.о., локализованной,
как правило, в 5'-фланкирующей области гена. Иногда под
контролем одного промотора считывается несколько генов c об-
разованием единого первичного РНК-транскрипта. Промоторные
области различных генов довольно разнообразны по своему нук-
леотидному составу. Однако, почти для всех промоторов харак-
терно наличие консервативной последовательности из 7 основа-
ний на расстоянии 19-27 нуклеотидов слева от сайта инициации
транскрипции. Это, так называемый, TATA -бокс (блок Хог-
несса), обеспечивающий корректное расположение РНК полимера-
зы по отношению к стартовому сайту. На расстоянии 70 - 80
п.о. в направлении 5'-конца от начала транскрипции часто
расположена другая консервативная последовательность из 9
п.о. - CAAT- бокс, контролирующий начальное связывание
РНК-полимеразы. Мутации в TATA- или в CAAT-боксах могут су-
щественно влиять на скорость синтеза РНК. В 5'-фланкирующей
области гена на расстоянии до тысячи пар оснований от начала
его кодирующей части располагаются другие регуляторные
последовательности, так называемые инхансеры (усилители),
способные резко увеличивать продукцию гена за счет увеличе-
ния скорости транскрипции. Эти контролирующие элементы могут
работать независимо от их ориентации по отношению к сайту
инициации. Для некоторых генов найдены участки ДНК, подавля-
ющие транскрипцию, а также так называемые аттенюаторы (осла-
бители) - последовательности, лежащие между сайтом инициации
транскрипции и собственно геном. Они могут блокировать прод-
вижение РНК-полимеразы. Благодаря такому сложному механизму
контроля, достигается очень тонкая и эффективная регуляция
экспрессии генов практически на всех этапах транскрипции,
трансляции и образования функционально зрелого белка. Эти
механизмы более детально рассмотрены в других разделах.
Раздел 2.5 Изменчивость генома, полиморфные сайты рест-
рикции, ПДРФ-анализ.
Кодирующие и регуляторные области структурных генов на-
иболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в
них подвержены давлению жесткого естественного отбора.
Действительно, небольшие изменения в этих последователь-
ностях, даже замена одного основания, делеция или инсерция
нескольких нуклеотидов, могут привести к прекращению синтеза
белка или к потере его функции, что, как правило, драмати-
ческим образом сказывается на жизнеспособности особей, несу-
щих подобные мутации. Однако, около 90% генома человека
состоит из некодирующих последовательностей, подобных сател-
литным ДНК, умеренным повторам, интронам и спейсерным проме-
жуткам между генами. Эти участки значительно более изменчивы
и содержат множество, так называемых нейтральных мутаций или
полиморфизмов, не имеющих фенотипического выражения и не
оказывающих заметного влияния на жизнеспособность или репро-
дуктивные свойства особей и, таким образом, не подверженных
прямому давлению естественного отбора. Полиморфные локусы
являются удобными генетическими маркерами. На основе анализа
родословных можно проследить их наследование в ряду поколе-
ний, проанализировать сцепление друг с другом, с известными
генами и с анонимными последовательностями ДНК, то есть
использовать в качестве обычных менделевских признаков в
классическом генетическом анализе. Информативность полиморф-
ных локусов определяется уровнем их генетической изменчи-
вости в различных популяциях.
Экспериментально легко выявляются два варианта геномно-
го полиморфизма. Количественые изменения в области локализа-
ции мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и ка-
чественные замены отдельных нуклеотидов, приводящие к появ-
лению полиморфных сайтов рестрикции. В первом случае измен-
чивость по числу повторенных "коровых " единиц создает серию
аллелей, характер и частота которых уникальны для каждого
вариабильного локуса. Полиморфизм в сайтах рестрикции связан
с присутствием точковых нейтральных мутаций, локализованых,
как правило, в уникальных последовательностях некодирующих
участков ДНК. Подобные мутации в силу вырожденности генети-
ческого кода (см.Глава 1) могут возникать и в кодирующих
последовательностях генов. Спонтанные мутации, возникающие в
сайтах узнавания для определенных рестриктаз, делают их ре-
зистентными к действию этих ферментов. Аналогичным образом,
при таких заменах могут создаваться новые сайты рестрикции.
Показано, что полиморфные локусы встречаются во всех хро-
мосомах с частотой приблизительно один полиморфный сайт на
300-500 п.о. Этот тип изменчивости ДНК был выявлен и исполь-
зован для молекулярной маркировки специфических участков ге-
нома исторически раньше по сравнению с вариабильными сател-
литными повторами (Botstein et al.,1980).
Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть
легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагмен-
тов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. Ана-
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
