|
При форме заболевания Нормандского типа, мимикриющей гемофи-
лию A, фактор Виллебранда структурно и функционально норма-
лен, за исключеним того, что нарушено его взаимодействие с
фактором YIII. У таких пациентов действительно идентифициру-
ются миссенс мутации, расположенные в области гена, кодирую-
щей сайты связывания фактора VIIIR с фактором VIIIС
(Mazurier, 1992).
Тип III представляет собой наиболее тяжелую форму забо-
левания, при которй фактор VIIIR, как правило, отсутствует.
Получены доказательства, что такие пациенты являются гомози-
готами или компаундами по нонсенс мутациям, обнаруживаемым в
одной дозе у больных типа I (Zhang et al., 1992). При этом
же типе заболевания выявлен кластер мутаций со сдвигом рамки
считывания, возникаюших в результате делеции одного из 6 ци-
тозинов в положении 2679-2684 экзона 18. Именно такая мута-
ция была обнаружена в семье, зарегистрированной впервые фон
Виллебрандом в 1926 году. У некоторых членов этой родослов-
ной как было установлено недавно, она находилась в компаунде
с мутацией P1266L, возникшей в результате рекомбинации между
геном F8VWF и псевдогеном (см. выше) (Zhang et al., 1993).
Выбор адекватного метода молекулярной диагностики бо-
лезни Виллебранда в значительной мере предопределяется пра-
вильностью предшествующей клинической и лабораторной диаг-
ностики и результатами медико-генетического консультирова-
ния, позволяющей достаточно четко определить характер насле-
дования заболевания в семье высокого риска и установить его
форму. К сожалению, достичь этого далеко не всегда возможно,
а отсутствие характерных мажорных мутаций значительно снижа-
ет эффективность прямой молекулярной диагностики. Вместе с
тем, по крайней мере, в некоторых популяций (Финляндия, Шве-
ция) обнаружены "горячие" точки мутаций, которыми являются
экзоны 18 и 42, при типе II болезни Виллебранда (Holmberg et
al,1993). В популяциях России такие "горячие " точки пока не
обнаружены, хотя исследования в этом направлении ведутся
(Асеев, Шауи Абдельрхани, 1995). Значительно более перспек-
тивной на современном этапе представляется непрямая диаг-
ностика. В промоторной части гена, в интронах
15, 17, 23, 40, 41, 49, а также в экзонах 26, 35, 39 иденти-
фицированы многочисленные полиморфные сайты рестрикции с
достаточно высоким уровнем полиморфизма. Особенно перспек-
тивным для диагностики является полиморфизм интрона
40, представляющий собой две области варьирующих по числу
тетрамерных повторов ТСТА на расстоянии 212 п.о. Амплифика-
ция этой части интрона 4О с помощью ПЦР, рестрикция AluI с
последующим электрофоретическим разделением позволяет иден-
тифицировать до 98 аллельных вариантов этого полиморфизма
(Mercter et al.,1991). Столь выраженный полиморфизм позволя-
ет с высокой эффективностью маркировать мутантную хромосому
(ген) и проследить её передачу в потомстве.
Сведения о генокоррекции болезни Виллебранда в доступ-
ной литературе не обнаружены.
10.4.6 Фенилкетонурия.
Фенилкетонурия (ФКУ) - одно из наиболее частых аутосом-
но-рецессивных заболеваний, обусловленных наследственным де-
фектом фенилаланингидроксилазы, приводящим при отсутствии
своевременной терапии к тяжелой умственной отсталости. В Ев-
ропе один больной ребенок встречается в среднем среди 10 -
17 000 новорожденных. В Ирландии и Шотландии частота ФКУ
достигает 1 на 4500 новоржденных (DiLella et al., 1986).
Распространена ФКУ также в Польше и в Белоруссии. В России
частота заболевания колеблется в пределах 1 : 8 - 10 000.
Очень важна ранняя диагностика ФКУ, так как при своевремен-
ном назначении пациенту диеты, не содержащей фенилаланин,
умственная ограниченность, как правило, не развивается или
имеет очень стертые формы. Разработаны биохимические скрини-
рующие тесты диагностики ФКУ у новорожденных.
Гидроксилирование фенилаланина является достаточно
сложным процессом, в котором участвуют, по крайней мере, 3
фермента. Фенилаланингидроксилаза (РАН), гомополимерный фер-
мент, состоящий из субъединиц с молекулярным весом 52 кД,
продуцируется клетками печени и регулирует превращение L-фе-
нилаланина в L-тирозин. Его дефицит приводит к накоплению
фенилаланина в сыворотке крови. Гиперфенилаланинемия может
возникать также при дефиците дигидроптеридинредуктазы и при
дефектах синтеза биоптерина. Однако, эти заболевания, хотя и
сопровождаются снижением активности РАН, значительно отлича-
ются от классической ФКУ и не коррегируются диетой, лишенной
фенилаланина.
PAH-ген транскрибируется в гепатоцитах с образованием
мРНК размером 2.4 кб. Наиболее распространенный тип мутаций
- однонуклеотдные замены (миссенс, нонсенс, мутации в сайтах
сплайсинга), причем часто эти мутации являются результатом
транзиций в 22-х обнаруженных в PAH-гене CpG динуклеотидах.
Крупных структурных перестроек не найдено, хотя имеется не-
большой процент точечных делеций. Отмечается неравномерный
характер внутригенной локализации мутаций (Scriver et
al.,1989). Так, наибольшее число миссенс мутаций встречается
в центральной части гена: в экзоне 7, кодирующем участок
связывания белка с кофактором, где располжено 5 CpG дупле-
тов, а также в экзонах 9 и 12. Преимущественный район лока-
лизации делеций - экзоны 1, 2 и 3.
Втури РАН-гена локализованоно более 10 полиморфных сай-
тов рестрикции, причем распределения гаплотипов по этим мар-
керам среди представителей разных рас и этнических групп
значительно различаются. Обнаружено сильное неравновесие по
сцеплению между определенными мутациями в PAH-гене и гапло-
типами по внутригенным сайтам рестрикции. Так, каждая из 5-и
наиболее частых в европейских популяциях мутаций ассоцииро-
вана только с одним из более, чем 70 гаплотипов по 8 рест-
рикционным полиморфизмам (Eisensmith et al., 1992). Мажорная
в западно-европейских популяциях сплайсинговая мутация в до-
норном сайте 12-го интрона сцеплена с гаплотипом 3 (DiLella
et al.,1986). В то же время другая мутация в экзоне 12 -
R408W, наиболее распространенная на востоке Европы, в част-
ности в Белоруссии и России, и не найденная в Японии и Ки-
тае, связана с гаплотипом 2 (DiLella et al.,1987). Мажорная в
Европе мутация R158Q в 40% сцеплена с гаплотипом 4, наиболее
частым среди жителей Японии и Китая. Распространенная в Тур-
ции сплайсинговая мутация в интроне 10, приводящая к
9-и-нуклеотидной инсерции, ассоциирована с "южными" гаплоти-
пами 6, 10 и 36.
Сопоставление частот различных гаплотипов по полиморф-
ным сайтам рестрикции и мутаций в PAH-гене в разных популя-
циях, национальностях и этнических группах позволяет сделать
вывод , что большинство из них, или даже все, произошли уже
после дивергенции рас. Распространение мажорных мутаций гена
РАН в различных популяциях и этнических группах связано с
эффектом основателя. По некоторым оценкам эти мутации воз-
никли однократно от нескольких сотен до нескольких тысяч лет
тому назад. Однако, в ряде случаев распределение мутаций не
может быть обьяснено в генетических терминах, сопоставимых с
демографической историей. Несомненно доказанными являются
примеры независимого и рекуррентного возникновения в разных
популяциях таких мутаций, как R261Q или R158Q. Высокие попу-
ляционные частоты специфических мутаций в PAH-гене связаны,
по-видимому, не только с эффектом основателя и/или с сущест-
вованием эндогенных механизмов повышенного мутагенеза, но и
с преимуществом гетерозигот. Высказано предположение, что
носительство РАН - мутаций повышает устойчивость организма к
токсическому эффекту охратоксина А, продуцируемого некоторы-
ми видами грибковой плесени (Aspergillus, Penicillium), раз-
вивающимися при хранении зерна и других продуктов
(Woolf,1986). Предполагается, что беременные женщины, гете-
розиготные пл РАН -мутациям имеют меньшую вероятность абор-
та, индуцированного действием этих микотоксинов. Возможно,
высокая частота ФКУ в Ирландии и Шотландии частично может
быть обьяснена мягким и влажным климатом этих стран,
способствующем росту таких грибов.
В медицинской практике используется как прямая, так и
косвенная диагностика мутаций в PAH-гене. Разработан очень
быстрый и эффективный метод ПЦР/StyI-диагностики cамой
частой в России (более 70%) мутации R408W (Ivaschenko,
Baranov, 1993; Иващенко и др., 1993). Дигностика других ма-
жорных мутаций в PAH-гене осуществляется методами ПЦР+АСО,
аллель-специфической амплификации (ARMS), методом одноните-
вого конформационного полиморфизма (SSCP) (см. Главу IY).
При первичном обследовании семьи черезвычайно удобно исполь-
зовать три полиморфные нейтральные мутации в кодонах 232,
245 и 385, сцепленные в Кавказских популяциях с определенны-
ми ПДРФ-гаплотипами, а значит и со специфическими мутантными
аллелями. Каждая из этих мутаций создает новый сайт рестрик-
ции и поэтому их аллельное состояние может быть легко проти-
пировано с помощью амплификации и рестрикции (Kalaydjieva et
al., 1991). При анализе семьи, в которой отсутствуют легко
идентифицируемые прямыми методами мутации, молекулярная ди-
агностика может быть проведена с помощью внутригенных поли-
морфных сайтов рестрикции. Удобен, в частности, Msp1-поли-
морфизм в 8-м экзоне, анализ которого может быть осуществлен
методом ПЦР/рестрикции (Wedmeyer et al., 1993). В последнее
время появились даные о наличии высокополиморфных сайтов
внутри интронов гена РАН, которые оказались особенно удобны-
ми для молекулярного маркирования мутантных аллелей (Goltzov
et al.1994).
Генокоррекция ФКУ успешно осуществлена в опытах in
vitro и в настоящее время находится на стадии эксперимен-
тальной разработки (Табл.9.2. Глава IX).
10.4.7 Синдром Леш-Нихана.
Синдром Леш-Нихана - рецессивное сцепленное с полом за-
болевание, обусловленное наследственной недостаточностью ги-
поксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT) и сопровож-
дающееся тяжелыми поражениями центральной нервной системы.
Фермент HPRT участвует в регуляции метаболизма пуринов,
контролируя превращение гуанина и инозина в соответствующие
рибонуклеотиды. Ген HPRT экспрессируется во всех типах кле-
ток с образованием мРНК размером 654 п.о.. Культивируемые
линии клеток, дефектные по HPRT, устойчивы к 8-азагуанину и
6-тиогуанину, и таким образом, могут быть отобраны на соот-
ветствующих селективных средах. Гетерозиготные носители му-
таций по HPRT-гену могут быть легко выявлены по наличию 2-х
типов клеток - устойчивых и чувствительных к 8-азагуанину, в
первичной культуре фибробластов или в клетках волосяных лу-
ковиц. В большинстве мутантных клеточных линий количество
мРНК нормально, а белок отсутствует. У части пациентов хотя
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57
|
