|
Меню
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Реферат: Белки: история исследования, химсостав, свойства, биологические функции
|
|
|
| /td> |
Секвенирование проводят методом, известным как метод Эдмана.
Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую
a-аминогруппу, каким-либо алкил- или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде
приводит к образованию соответствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой
среде приводит (при значениях кислотности, не повреждающих пептидной связи)
отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина. Оригинальная процедура
Эдмана основана на использовании фенилизотиоцианата и тем самым на образовании
фенилтиогидантоинов:
В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал
аминокислоты R1, который может быть идентифицирован путем измерения
какой-либо физической или физико-химической характеристики, позволяющей
различать гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков
аминокислотам. В качестве такой характеристики может служить хроматографическая
подвижность в какой-либо предварительно проградуированной по стандартным
образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью
масс-спектрометра.
Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к
укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид,
исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу
второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два
звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность
последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки
аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически метод Эдмана
позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному
повторению одних и тех же чередующихся процедур: добавления изотиоцианата,
отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей
идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде пригодном для
следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной
работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на
каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения
вех перечисленных операций - автоматические секвенаторы полипептидов. С
их помощью удается произвести до 40 - 60 шагов ступенчатой деградации.
Завершающим этапом установления первичной структуры белка является
восстановление порядка, в котором просеквенированные фрагменты располагались в
исходном полипептиде. Чаще всего для этой цели исползуют подход изветный как
метод перекрывающихся белков. Ниже излагается основная идея метода.
Если установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением
исследуемого белка с помощью трипсина (далее такие полипептиды обозначаются
буквой Т - от слова “трипсиновые”), то остается определить для каждого из
этих пептидов, с какими двумя Т-пептидами он соседствует с N- и С-конца. В
структуре просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью
отсутствует. Однако ее можно частично, а в ряде случаев и полностью
восстановить, если располагать аналогичными данными для серии полипептидов,
полученных расщеплением того же исследуемого белка по какой-либо другой
группе аминокислотных остатков. Для определенности ниже речь будет идти о
полипептидах, полученных расщеплением химотрипсином (пептиды группы С,
chymotryptic).
Как видно из рисунка, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи,
то существует С-пептид, который либо содержит в своем составе полностью оба
или один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С-концевую
часть левого и N-концевую часть правого пептида группы Т. этот С-пептид
перекрывает два соседних Т-пептида, с чем и связано название метода.
Таким образом, просматривая структуры пептидов Т и С, можно для любой пары Т-
пептидов выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или разделены
одним или несколькими другими Т-пептидами. Неоднозначность может появиться
только в том случае, если перекрываемый каким-либо из С-петидов концевой
фрагмент встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность этого как
правило невелика. Если это все же происходит, то применяют более сложные
методы комбинаторики.
Глава 8. Химический синтез полипептидов и белков
Химический синтез полипептидов и белков имеет большое практическое и
теоретическое значение. В практическом отношении важны белковые гормоны -
инсулин и вазопрессин, в настоящее время получаемые синтетическим путем.
Интересны и имеют практическое применение пептиды группы пептидов мозга:
метионин-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met) и лейцин-энкефалин (Tyr-Gly-Gly-Phe-
Leu). Эти соединения оказывают на мозговые центры такое же действие, как и
морфин. Таким образом они могут применяться в качестве анальгетика, однако
они практически не вызывают привыкания.
Традиционные методы синтеза регулярных полимеров позволяют получить
сополимеры, состоящие из двух (или более) сходных типов мономеров со
статистическим распределением их по цепи, в том числе белков. В частности,
возможно получение гомополимеров или статистических сополимеров, состоящих из
аминокислотных остатков, связанных пептидными связями (полиаминокислот).
В качестве примера можно привести процесс получения полиаминокислот, основанный
на конденсации N-карбоксиангидридов аминокислот, образуемых из
соответствующих аминокислот обработкой фосгеном:
Эти соединения содержат электрофильную ангидридную группу, которая может
атаковать алифатическую аминогруппу аминокислоты, используемой в качестве
затравки, с выделением СО2 и одновременном освобождением новой
аминогруппы из атакующей молекулы N-карбоксиангидрида, таким образом открывая
возможность поликонденсации:
Нетрудно заметить, что каждая стадия поликонденсации (с учетом реакции
образования N-карбоксиангидридов аминокислот) сопровождается превращением
молекулы COCl2 в CO2 и 2HCl, что термодинамически выгодно
и является источником свободной энергии для образования пептидной связи.
При синтезе нерегулярных полипептидов базируются также на активации
карбоксильных групп. Большинство из них базируется на использовании
N,N-дициклогексилкарбодиимида (ДЦК). Он способен в присутствии RCOO-
и амина NH2R’ осуществить активацию карбоксильных групп:
Промежуточнам соединением является O-ацил-N,N’-дициклогексилмочевину (ДЦМ):
Обычно ДЦК в пептидном синтезе используется не непосредственно, а для синтеза
стабильных реакционноспособных производных аминокислот, ангидридов или
активированных эфиров путем реакции с соответствующими гидроксисоединениями:
Вследствие нуклеофильного характера, должны содержать сильный электронный
акцептор Х.
NH2CHR1C(O)-NHCHR2C(O)-OX |
|
Тем не менее эти соединения нельзя непосредственно использовать для синтеза
пептидов определенной структуры. Смешивая две аминокислоты с активированными
карбоксильными группами, можно получить четыре разных дипептида:
NH2CHR1C(O)-OX + NH2CHR1C(O)-OX |
|
Более того из-за наличия активных групп процесс может идти дальше. Но в
результате получается только статистический полимер.
Для предотвращения образования лишних полипептидов необходимо исключить участие
в процессе аминогруппы первой аминокислоты и активированной аминогруппы второй
(в результате получается пептид
). Это достигается
использованием защитных групп Z на тех функциональных группах, которые
не должны вступать во взаимодействие. Реакция
Должна приводить к одному определенному дипипептиду. Этот пептид
нереакционноспособен и для продолжения процесса необходимо удалить одну из
защитных групп Z1,Z2, для того чтобы открыть либо NH
2, либо СООН-группу для следующей стадии удлинения пептидной цепи. Поэтому
главным требованием к защитным группам является возможность их мягкого
селективного удаления, не повреждающего пептидную связь. Наиболее широко для
защиты a-аминогрупп используется трет-бутилоксикарбонильная группа
(Вос), которую легко ввести в аминогруппу обработкой аминокислоты
соответствующим N-гидроксисукциниимидным эфиром:
Эту группу легко удалить слабой кислотной обработкой пептида, при которой эта
связь не разрушается:
| | | | | 
| | | | | | | + NH2CHR1C(O)-NHCHR2C(O)-Z2 |
| |
В качестве группы Z2 используют эфирные группы, которые стабильны в
кислой среде в условиях проведения синтеза и могут быть селективно удалены
мягкой щелочной обработкой.
Специфической особенностью полипептидного синтеза является огромное число
идентичных стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе: образование
новой пептидной связи, удаление защитной группы для подготовки к следующей
стадии элонгации (удлинения) цепи и промежуточные отмывки от избытка реагентов
и побочных продуктов после каждого химического превращения. метод,
разработанный Р.Меррифилдом, дал возможность автоматизировать этот процесс и
снизить механические потери. Согласно этому методу, первый мономер во вновь
строящейся цепи синтезируемого полипептида ковалентно связывается с
нерастворимым носителем (смолой - сополимер стиролдивинилбензола) и все
последующие стадии проводятся с полипептидом, растущим на этой смоле. Этот
метод известен как твердофазный синтез полипептидов. К смоле
попеременно добавляют очередной синтон (мономер, содержащий набор защитных
групп и в ряде случаев активированные остатки) и реагент для удаления концевой
защитной группы (обычно в остаток). Химические стадии сопровождаются
соответствующими промывками. В течение всего процесса пептид остается связанным
со смолой. Поместив в колонку смолу, с которой связан синтезируемый полипептид,
можно легко автоматизировать процесс, запрограммировав смену потоков через
колонку: синтон (мономер) - растворитель - смесь для удаления защиты -
растворитель и т.д. разработаны специальные приборы для автоматизированного
полипептидного синтеза. Применение такого прибора позволяет получить такие
сложные полипептиды, как 99-членный полипептид - протеазу, кодированную ВИЧ-1.
Эта протеаза нужна для протеолитического разрезания больших полипептидов,
образовавшихся при трансляции (белковом синтезе) вирусных и-РНК. Огромный
интерес к этой протеазе обусловлен надеждой найти специфические ингибиторы
замедляющие работу этого фермента и следовательно предотвратить образование
вирусных частиц. Для синтеза приведенной выше протеазы на автоматическом
пептидном синтезаторе “Applied Biosystem” потребовалось около 200 химических
процедур, не считая промывок, предшествующих каждой смене реагента. На
завершающей стадии защищенный полипептид, ковалентно связанный со смолой,
снимается с нее и защитные группы удаляются соответствующими обработками.
Глава 9. Биологические функции белков
Функции белков чрезвычайно многообразны. Каждый данный белок как вещество с
определенным химическим строением выполняет одну узкоспециализированную
функцию и лишь в нескольких отдельных случаях – несколько взаимосвязанных.
Например, гормон мозгового слоя надпочечников адреналин, поступая в кровь,
повышает потребление кислорода и артериальное давление, содержание сахара в
крови, стимулирует обмен веществ, а также является медиатором нервной системы
у холоднокровных животных.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11
|
