|
Меню
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Реферат: Белки: история исследования, химсостав, свойства, биологические функции
|
|
|
| /td> |   19. Триптофан, a-амино-b-индолил-пропионовая к-та
| CH2 – CH – COOH | NH2 | Try, Trp | W |    20. Гистидин, a-амино-b-имида-золилпропионовая
к-та | N CH2 – CH – COOH | NH NH2 | His | H | Иминокислоты |  21. Пролин
| - СOOH NH | Pro | P | | | | | |
Приложение II
Открытие аминокислот в составе белков
Аминокислота | Год | Источник | Кто впервые выделил | 1. Глицин | 1820 | Желатина | А.Браконно | 2. Лейцин | 1820 | Мышечные волокна | А.Браконно | | 1839 | Фибрин, шерсть | Г.Мульдер | | 3. Тирозин | 1848 | Казеин | Ф.Бопп | | 4. Серин | 1865 | Шелк | Э.Крамер | 5. Глутамино- вая к-та | 1866 | Растительные белки | Г.Риттхаузен | 6. Аспарагино- вая к-та | 1868 | Конглутин, легумин | Г.Риттхаузен | | 7. Фенилаланин | 1881 | Ростки люпина | Э.Шульце, Й.Барбьери | | 8. Аланин | 1888 | Фиброин шелка | Т.Вейль | | 9. Лизин | 1889 | Казеин | Э.Дрексель | | 10. Аргинин | 1895 | Вещество рога | С.Хедин | | 11. Гистидин | 1896 | Стурин, гистоны | А.Коссель; С.Хедин | | 12. Цистин | 1899 | Вещество рога | К.Мёрнер | | 13. Валин | 1901 | Казеин | Э.Фишер | | 14. Пролин | 1901 | Казеин | Э.Фишер | | 15. Оксипролин | 1902 | Желатина | Э.Фишер | | 16. Триптофан | 1902 | Казеин | Ф.Гопкинс, Д.Кол | | 17. Изолейцин | 1904 | Фибрин | Ф.Эрлих | | 18. Метионин | 1922 | Казеин | Д. Мёллер | | 19. Треонин | 1925 | Белки овса | С.Шрайвер | | 20.Оксилизин | 1925 | Белки рыб | С.Шрайвер |
Приложение III
Цветные реакции на белки
Цветные реакции применяются для установления белковой природы веществ,
идентификации белков и определение их аминокислотного состава в различных
биологических жидкостях. В клинической лабораторной практике эти методы
используются для определения количества белка в плазме крови, аминокислот в
моче и крови, для выявления наследственных и приобретенных патологий обмена у
новорожденных.
Биуретовая реакция на пептидную связь.
В основе ее лежит способность пептидных связей (– CO–NH– ) образовывать с
сульфатом меди в щелочной среде окрашенные комплексные соединения,
интенсивность окраски которых зависит от длины полипептидной цепи. Раствор
белка дает сине-фиолетовое окрашивание.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р (белок куриного яйца фильтруют через марлю и
разводят дист-ой водой 1:10); 2) NaOH, 10% р-р; 3) Cu(OH)2, 1% р-р.
Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, 3 капли
NaOH, 1 каплю Cu(OH)2, перемешивают. Содержимое пробирки
приобретает сине-фиолетовое окрашивание.
Нингидриновая реакция.
Сущность реакции состоит в образовании соединения, окрашенного в сине-
фиолетовый цвет, состоящего из нингидрина и продуктов гидролиза аминокислот.
Эта реакция характерна для аминогрупп в a-положении, присутствующих в
природных аминокислотах и белках.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) нингидрин, 0,5% водный р-р.
Ход определения. В пробирку вносят 5 капель р-ра яичного белка, затем 5
капель нингидрина, нагревают смесь до кипения. Появляется розово-фиолетовое
окрашивание, переходящее с течением времени в сине-фиолетовое.
Ксантопротеиновая реакция.
При добавлении к р-ру белка конц-ой азотной к-ты и нагревании появляется
желтое окрашивание, переходящее в присутствии щелочи в оранжевое. Сущность
реакции состоит в нитровании бензольного кольца циклических аминокислот
азотной к-ой с образованием нитросоединений, выпадающих в осадок. Реакция
выявляет наличие в белке циклических аминокислот.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) конц. азотная к-та; 3)NaOH,10% р-р.
Ход определения. К 5 каплям р-ра яичного белка добавляют 3 капли азотной
к-ты и (осторожно!) нагревают. Появляется осадок желтого цвета. После
охлаждения добавляют (желательно на осадок) 10 капель NaOH, появляется
оранжевое окрашивание.
Реакция Адамкевича.
Аминокислота триптофан в кислой среде, взаимодействуя с альдегидами кислот,
образует продукты конденсации красно-фиолетового цвета.
Реактивы: 1) неразбавленные яичный белок, 2) конц. (ледяная) уксусная к-та;
3) конц. серная к-та.
Ход определения. К одной капле белка прибавляют 10 капель уксусной к-ты.
Наклонив пробирку, осторожно по стенке добавляют по каплям 0,5 мл серной к-ты
так, чтобы жидкости не смешивались. При стоянии пробирки на границе жидкостей
появляется красно-фиолетовое кольцо.
Реакция Фоля.
Аминокислоты, содержащие сульфгидрильные группы – SH, подвергаются щелочному
гидролизу с образованием сульфида натрия Na2S. Последний,
взаимодействуя с плюмбитом натрия ( образуется в ходе реакции между ацетатом
свинца и NaOH), образует осадок сульфида свинца PbS черного или бурого цвета.
Na2S + Na2PbO2 + 2H2O ® PbS¯ + 4NaOH.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) реактив Фоля ( к 5% -р-ру ацетата
свинца прибавляют равный объем 30% р-ра NaOH до растворения образовавшегося
осадка).
Ход определения. К 5 каплям р-ра белка прибавляют 5 капель реактива Фоля
и кипятят 2-3 мин. После отстаивания 1-2 мин появляется черный или бурый
осадок.
Приложение IV
Реакции осаждения белков.
Белки в р-ре и соответственно в организме сохраняются в нативном состоянии за
счет факторов устойчивости, к которым относятся заряд белковой молекулы и
гидратная оболочка вокруг нее. Удаление этих факторов приводит к склеиванию
молекул белков и выпадению их в осадок. Осаждение белков может быть обратимым
и необратимым в зависимости от реактивов и условий реакции. В клинической
лабораторной практике реакции осаждения используют для выделения альбуминовой
и глобулиновой фракций белков плазмы крови, количественной характеристики их
устойчивости в плазме, обнаружения белков в биологических жидкостях и
освобождения от них с целью получения безбелкового р-ра.
Обратимое осаждение.
Под действием факторов осаждения белки выпадают в осадок, но после
прекращения действия (удаления) этих факторов белки вновь переходят в
растворимое состояние и приобретают свои нативные свойства. Одним из видов
обратимого осаждения белков является высаливание.
Высаливание. Насыщенным р-ом сульфата аммония осаждается альбуминовая
фракция белков, полунасыщенным р-ром – глобулиновая фракция.
Сущность реакции заключается в дегидратации молекул белка.
Реактивы: 1)неразведенный яичный белок; 2) насыщенный р-р сульфата аммония; 3)
NaOH, 10% р-р, 4) CuSO4, 1% р-р; 5) дистл-ая вода; 6)сульфат аммония
в порошке.
Ход определения. В пробирку наливают 30 капель неразв-го яичного белка и
добавляют равное количество насыщенного р-ра сульфата аммония. Содержимое
пробирки перемешивают. Получают полунасыщенный р-р сульфата аммония, при этом
глобулиновая фракция осаждается, а альбуминовая остается в р-ре. Последнюю
отфильтровывают, затем смешивают с порошком сульфата аммония до тех пор пока не
прекратится раств-ие соли, при этом выпадает осадок – глобулины.
Необратимое осаждение белков.
Необратимое осаждение белков связано с глубокими нарушениями структуры белков
(вторичной и третичной) и потерей ими нативных свойств. Такие изменения
белков можно вызвать кипячением, действием конц. р-ров минеральных и
органических к-т, солями тяжелых металлов.
Осаждение при кипячении.
Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60°С
денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении
гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и
развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение
происходит в изоэлектрической точке (когда заряд молекулы равен нулю),
поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие
кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными
свойствми – в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных р-рах
денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы
перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором –
отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в р-ре.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) уксусная к-та, 1% и 10% р-ры; 3) NaOH,
10% р-р.
Ход определения. В 4 пронумерованные пробирки приливают по 10 капель р-ра
яичного белка. Затем 1-ю пробирку нагревают до кипячения, при этом р-р мутнеет,
но т.к. частицы денатурированного белка несут заряд, они в осадок не выпадают.
Это связано с тем, что яичный белок имеет кислые свойства ( его
изоэлектрическая точка 4,8) и в нейтральной среде заряжен отрицательно; во
вторую пробирку добавляют 1 каплю 1% р-ра уксусной к-ты и нагревают до
кипячения. Белок выпадает в осадок, т.к. его р-р приближается к
изоэлектрической точке и белок теряет заряд ( один из факторов устойчивости
белка в р-ре); в 3-ю пробирку добавляют 1 каплю 10% р-ра уксусной к-ты и
нагревают до кипения. Осадка не образуется, т.к. в сильнокислой среде частицы
белка приобретают положительный заряд ( сохраняется один из факторов
устойчивости белка в р-ре); в 4-ю пробирку наливают 1 каплю р-ра NaOH,
нагревают до кипения. Осадок не образуется, поскольку в щелочной среде
отрицательный заряд белка увеличивается.
Осаждение концентрированными минеральными к-тами.
Концентрированные кислоты (серная, хлористоводородная, азотная и др.)
вызывают денатурацию белка за счет удаления факторов устойчивости белка в р-
ре (заряда и гидратной оболочки). Однако при избытке хлористоводородной и
серной к-т выпавший осадок денатурированного белка снова растворяется. По-
видимому, это происходит в результате перезарядки молекул белка и частичного
их гидролиза. При добавлении избытка азотной к-ты растворения осадка не
происходит. Вот почему для определения малых количеств белка в моче при
клинических исследованиях применяется азотная к-та.
Реактивы: 1) яичный белок,1% р-р; 2) конц. серная к-та; 3) конц.
хлористоводородная к-та; 4) конц. азотная к-та.
Ход определения. В три пробирки наливают по 5 капель концентрированной
серной, хлористоводородной и азотной к-т. затем, наклонив пробирку под углом
45°, осторожно по стенке наслаивают такой же объем яичного белка. На границе
двух слоев появляется осадок белка в виде белого кольца. Осторожно встряхивают
пробирки, наблюдают растворение белка в пробирках с серной и
хлористоводородной к-тами, в пробирке с азотной к-ой растворения белка не
происходит.
Осаждение органическими к-ами.
Трихлоруксусноая к-та осаждает только белки, а сульфосалициловая осаждает не
только белки, но и высокомолекулярные пептиды. Сульфосалициловой к-ой
пользуются при определении белка в моче.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) трихлоруксусная к-та, 10% р-р; 3)
сульфосалициловая к-та, 10% р-р.
Ход определения. В две пробирки вносят по 5 капель р-ра белка. В одну из
них прибавляют 2 капли сульфосалициловой к-ты, а в другую – 5 капель
трихлоруксусной к-ты. В пробирках выпадает осадок белка.
Осаждение белка солями тяжелых металлов.
Белки при взаимодействии с солями свинца, меди, ртути, серебра и других
тяжелых металлов денатурируются и выпадают в осадок. Однако при избытке
некоторых солей наблюдается растворение первоначально образовавшегося осадка.
Это связано с накоплением ионов металла на поверхности денатурированного
белка и появлением положительного заряда на белковой молекуле.
Реактивы: 1) яичный белок, 1% р-р; 2) сульфат меди, 10% р-р; 3) ацетат
свинца, 5% р-р; 4) нитрат серебра, 5% р-р.
Ход определения. В три пробирки вносят по 5 капель белка. В первую
добавляют 1 каплю ацетата свинца, в третью – 1 каплю нитрата серебра. Во всех
пробирках выпадает осадок. Затем в первую пробирку добавляют 10 капель нитрата
серебра – растворения осадка нет.
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11
|