Лучше всего для получения нужной и стойкой реакции воды применять буферные рас-творы. Хорошими буферными растворами для этой цели будут фосфатные. Для них нужно иметь два исходных раствора:

1. Двуосновного фосфата натрия (Na2HP04. *2Н20)--17,814 г на 1 л (рН =8,302).

2. Одноосновного фосфата калия (КН2Р04) -- 13,638 г на 1 л (рН =4,529).

Азур II -- смесь в равных частях красок: азур I (диметилтиониохлорид) и метиленовой синьки. В постарев-шем растворе исходной краски Гимза метиленовая синька часто плохо окрашивает цитоплазму лимфоцитов (нет чисто голубого цвета). Тогда необходимо добавить метилено-вой синьки в исходный раствор краски.

Если к литру дистиллированной воды прибавить по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды будет равен 6,813. Случайные колебания концентра-ции углекислоты в воздухе при таком способе не ока-зывают влияния на рН воды.

Перед окраской (ex tempore) к дистиллированной воде прибавляют исходный раствор краски Гимза из расчёта 1,0--1,5 капли краски на 1 см3 воды.

Рабочий раствор краски наливается пипеткой (ос-торожно!) на предметное стекло так, чтобы препарат (мазок крови) был полностью покрыт краской. Стёк-ла помещаются над широкой чашкой Петри на стек-лянных палочках, соединённых резиновыми трубками попарно. Во избежание осадков, которые невозможно отмыть, можно стёкла укладывать мазками вниз, на стеклянные палочки, лежащие в чашке Петри, так, чтобы краска покрывала мазки полностью (способ академика Н. Д. Стражеско).

При первом способе на один мазок тратится 2,5-- 3,0 см3 рабочего раствора краски.

Через 20--30 минут краску сливают, препараты промывают водопроводной чистой водой и высуши-вают на воздухе. Для окраски старой краской тре-буется меньше времени.

При окраске раствором Гимза хорошо дифференцируется структура ядра, несколько хуже -- структура цитоплазмы, особенно нейтрофильная зернистость. Однако при очень умелом окрашивании и зернис-тость выявляется достаточно хорошо.

По этому методу плохо окрашиваются псевдоэозинофилы (палочкозернистые гранулоциты) крови сель-скохозяйственных птиц.

Окрашенные краской Гимза ядра имеют красивый фиолетово-красный цвет (цвет вишни); нейтрофиль-ная зернистость -- розовато-фиолетовый; эозинофильная зернистость -- розовый или красно-розовый; базофильная --цвета мальвы; азурофильная -- красно-фиолетового цвета.

Цитоплазма лимфоцитов -- голу-бая, моноцитов -- от голубовато-серой до пепельно-серой.

Эритроциты -- красновато-розового цвета, полихроматофилъные эритроциты -- синеватые, базофильная пунктация эритроцитов -- синяя.

Если нет хорошей готовой краски Гимза, то можно хорошо окрасить мазки по Н о х т у. Для окраски по Нохту приготовляется два раствора: 1) 1-промил-льный раствор азура II; 2) 1-промилльный раствор эозина. Перед приготовлением рабочего раствора кра-ску нужно оттитровать. Для этого сначала берут на 3 см3 дистиллированной воды 4 капли раствора азу-ра II и 3 капли раствора эозина (т. е. в отношении 4 : 3). Если окраска мазков неправильна, пробуют отношение 4 : 4, или 4 : 5, или 4 : 6, и т. д.

Достаточно интенсивное окрашивание получается, если на 1,5 см3 азура II берётся 1,0 см3 эозина и 6 см3 воды.

Модификация Паппенгейма (Май-Грюнвальд -- Гимза)

При этом способе окраски предварительная фик-сация мазка не нужна, так как первая краска -- Май-Грюнвальд имеет растворителем метиловый спирт.

Метод окраски двухмоментный. Сперва мазок по-крывают 2 см3 неразведённой краски

Май-Грюнвальд, представляющей собой раствор в метиловом спирте эозина и метиленовой синьки. Если нет гото-вой надёжной краски, то растворяют приготовленный фабричным способом сухой порошок Май-Грюнвальд: 1,0 г порошка на 100 см3 абсолютного метилового спирта и 50 см3 чистого глицерина. Хорошая крас-ка получается и без глицерина.

Через 3 минуты к краске Май-Грюнвальд, находя-щейся на мазке, прибавляют 2 см3 дистиллированной воды и тщательно смешивают их продуванием или последовательным набиранием и выпусканием через тонко оттянутую пипетку. Когда, примерно через 1 минуту, мазок приобретает розовый оттенок, крас-ку с препарата сливают и после этого, не высуши-вая, 10--12--15 минут красят мазок рабочим рас-твором краски Гимза, а затем промывают чистой водопроводной водой. Этот способ окраски удачно сочетает хорошее выявление зернистости клеток кра-ской Май-Грюнвальд с чёткой окраской структуры ядра раствором Гимза.

Такая окраска особенно ценна для выявления псевдоэозинофилов (специальных гранулоцитов) ку-риной крови.

Результаты окраски: ядра красно-фиолетовые, ци-топлазма лимфоцитов голубовато-синяя, азурофильная зернистость лимфоцитов пурпурно-красная, миелоидная азурофилия фиолетово-коричневая, так же как и центральная субстанция кровяных пластинок. Нейтрофильная зернистость коричневато-красная, до синевато-розовой; эозинофильная -- от красно-оранжевой до кирпично-красного цвета; базофильная зернистость тёмного ультрамариново-фиолето-вого цвета (метахромазия); эритроциты медно-розовые; полихроматофильные эритроциты синеватые; базофильная пунктация эритроцитов (слабо выявляе-мая) синего цвета *.

В целом, мазки, окрашенные по этому способу, несколько богаче оттенками, чем при окраске раство-ром Гимза, но кажутся более тёмными, «мрачными».

Цветные таблицы картин крови выполнены с препаратов крови, окрашенных по Романовскому в модификации Паппенгейма, лучше всего диференцирующей струк-туру клеток.

Ускоренная окраска раствором Гимза (новая модификация)

Этот метод даёт хорошие результаты только в ру-ках опытного исследователя. Преимущество -- бы-строта приготовления препарата, так как фиксация и окрашивание происходят одновременно.

Для работы необходимы капельницы ёмкостью в 30 см3, в которые наливается исходный раствор краски Гимза, разведённый пополам метиловым спир-том или чистейшим ацетоном. В хорошо закупоренной склянке этот раствор может сохраняться месяцами.

Окрашивание производится или в чашках со спе-циальными перекладинками, или в обычных чашках Петри. На свежий мазок (не позднее 2-дневного!), высушенный на воздухе и не фиксированный, нали-вают из капельницы около 20 капель краски. Чтобы предохранить краску от испарения, чашка, в которой лежат препараты, закрывается стеклом.

Через 1/2 минуты -- 1 минуту к краске на мазке приливают около 10 см3 подщелочённой дистиллированной воды (1--2 капли 1-процентного раствора щелочи на 50 см3 воды). Покачиванием чашечки хорошо перемешивают краску с подлитой водой. Через 10-- 15 минут воду с краской сливают и мазок промывают водопроводной (недистиллированной!) водой.

В случае приготовления основного раствора с аце-тоном особенно хорошо выявляется зернистость структура ядер кровяные пластинки.

* Описание цветов дано, с некоторыми небольшими изменением, по А. II. Крюкову.

Окраска крови и кровепаразитов по Г. Эпштейну

Фиксация метиловым спиртом

Готовят два раствора.

1-й: дистиллированной воды 100 см3; лимоннокислого лития -- 1 г; толуидиновой голубой -- 1г. По-сле разведения профильтровать.

2-й: насыщенный водный раствор пикриновой кислоты.

Мазки красят 20--30 минут в первом растворе и, ополоснув в проточной воде, помещают на 1--2 секунды во второй раствор (пикриновой кислоты). Промывают (тщательно!) снова в водопроводной воде и после этого быстро обсушивают фильтровальной бумагой.

Окраска: эритроциты зелёные; ядра лейкоцитов фиолетово-синие; базофильная зернистость вишнё-вая; эозинофильная зернистость изумрудно-зелёная; нейтрофильная зернистость серая; у кровепаразитов ядро красное, а цитоплазма синяя.

Окраска составом Лейшмана

На нефиксированный препарат налить 15--20 ка-пель готового раствора краски Лейшмана (0,1 г порошка краски растворить в 10 см3 метилового спирта). Через 2,5--3 минуты прибавить 30 капель дестиллированной воды и красить ещё 5 минут. Про-мыть в течение 2--3 минут проточной водой и высу-шить на воздухе.

Специальные способы окраски и фиксации мазка

а) Получение и окраска толстой капли. На хорошо промытое (подщелочённой водой, затем спиртом с эфиром) предметное стекло наносят 2 крупные капли крови. Собственно, достаточно одной капли, но вто-рая служит «резервом» на случай неосторожного сти-рания одной капли, неудачи окраски и т. д. Каждая капля сейчас же, с помощью иглы, распределяется по стеклу ровным слоем -- примерно в 1\4 - 1\2 мм толщины, чтобы получились пятна размером с деся-тикопеечную монету. Препараты тщательно высуши-ваются (в термостате при 37° или на солнце) в течение получаса.

После этого высохший препарат дважды окраши-вают рабочим раствором Гимза (1 капля исходного спиртового раствора Гимза на 1 см3 дистиллирован-ной воды).

Первое окрашивание длится около 3 минут после того, как в растворе краски появится красное облачко растворившегося гемоглобина. Затем один конец предметного стекла слегка приподни-мают и старый раствор Гимза заменяют новым, при-ливая его очень осторожно с приподнятого конца препарата, в то время как прежний раствор краски с гемоглобином стекает с другого конца. Когда таким образом вся старая краска сменена новой, предмет-ное стекло снова устанавливают горизонтально и продолжают докрашивание ещё 25 минут.

Значение метода состоит в том, что в толстой капле удается обнаружить таких паразитов крови, которые находятся в ней в небольших количествах. Быстро устанавливается наличие или отсутствие эозинофилов и производится их подсчет их подсчёт.

То же самое в отношении базофильных эритроцитов.

б) Оксидазная и пероксидазиая реакции лейкоцитов. Оксидазная реакция основана на возникновении индофеноловой голубой краски при воздействии оки-сляющих ферментов на анафтол и диметилпарафенилендиамин; в местах локализации оксидаз в клетке возникает синее окрашивание.

Техника реакции состоит в следующем:

1. Фиксация мазка в смеси из 1 части 40-про-центного формальдегида и 9 частей 95-процентного спирта в продолжение нескольких секунд пли 40-процентного формальдегида и абсолютного алкоголя аа в продолжение 15--20 минут.

2. Окраска: а) 3 минуты слегка разведённым 1-процентным водным щелочным раствором анафтола (раствор приготовляется следующим образом: анафтол при нагревании в дестиллированной воде поднимается кверху и плавает в жидком виде; после введения в раствор кристалла едкой щёлочи анаф-тол растворяется в воде); б) не удаляя анафтола, на препарат наслаивают 1-процентный водный раствор диметилпарафенилендиамина. Через несколько ми-нут зернистость лейкоцитов, содержащая оксидазу, становится темносиней. Докрашивается препарат сильно разведённым раствором фуксина Циля.

Пероксидазная реакция.

а) Окраска по Край-биш в модификации Грэма. Хорошо высохший мазок в течение 10--15 минут фиксиро-вать жидкостью, состоящей из 1 части 40-процент-ного формалина и 9 частей 95-процентного спирта. После фиксации слегка промыть водой и покрыть раствором бензидина (приготовление: к 10 см3 40-процентного этилового спирта прибавляется не-сколько кристаллов бензидина +00,2 см3 3-процент-ной перекиси водорода). Окраска длится 5 минут. Затем смыть водой.

Места локализации пероксидаз окрашиваются сначала в сероватый, а затем в золотисто-коричне-вый цвет.

Последующее докрашивание -- тионином, метиленовой синькой или краской Гимза.

б) Окраска по Сато. Воздушносухие маз-ки фиксируют в течение 30 секунд 1/2-процентным раствором медного купороса (CuS04) и затем окраши-вают бензидином с перекисью водорода (рецепт приготовления -- как в предыдущем методе). Через 2 минуты препарат осторожно промывают дистил-лированной водой, на мазок наливают слой 1-процент-ного водного раствора сафранина, через 15--20 минут сафранин смывают водой и высушивают препарат на воздухе (избегать высушивания фильтровальной бу-магой!).

Пероксидазо-положительные гранулы окрашивают-ся в темносиний цвет, ядра -- в красно-жёлтый; эритроциты не окрашиваются.

Посредством оксидазной и пероксидазной реакций облегчается диференциация миэлоидных клеток от лимфоидных. Обе реакции дают аналогичные резуль-таты, но оксидазная реакция более чувствительна.

Нейтрофилы и эозинофилы реагируют резко поло-жительно, базофилы так же, но только на ранних стадиях развития. Зрелые формы оксидазо-отрицательны. Однако ряд авторов считает, что и зрелые базофилы оксидазо-положительны.

Лимфоциты дают безусловно отрицательную реак-цию. Моноциты -- иногда очень слабо положительную.

С клинической точки зрения представляет инте-рес тот факт, что при некоторых инфекционных забо-леваниях у нейтрофилов исчезают положительная оксидазная п пероксидазная реакции.

в) Окраска токсической зерни-стости раствором Гимза при рН =5,4. Токсическую зернистость, в отличие от обычной, нормальной зернистости гетерофилов (нейтрофилов), избирательно окрашивают, при окраске по принципу Романовского раствором краски Гимза, применяя буферный раствор с рН =5,4.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14