|
25 мМ трис-HCl, рН 7,4). Смесь наносили при комнатной температуре на равный
объем среды для выделения лейкоцитов, содержащей 24 части 9% фикола и 10
частей 34% верографина. После центрифугирования при 400 g в течение 30 мин
отбирали слой лейкоцитов и разводили в большом объеме буфера TBS. После
повторного центрифугирования при 300 g в течение 40 мин для лизиса
остаточных эритроцитов клетки суспендировали в растворе, содержащем 9
объемов 0,83% раствора NH4Cl и 1 объем 2,06% раствора трис-HCl, рН 7,62, до
концентрации 108 кл/мл и добавляли 5 объемов среды. После осаждения клеток
при 300 g в течение 10 мин процедуру очистки повторили (Фримель, 1987).
ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ
Осадок лейкоцитов после выделения и очистки суспендировали в 10
объемах (1 мл) раствора 1, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат
натрия, рН 7,0, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол, при комнатной
температуре. Затем добавляли 0,1 мл 2 М раствора NaAc, рН 4,0, 1 мл фенола,
0,2 мл хлороформа и перемешивали. Затем центрифугировали при 10000 g в
течение 20 мин при 4оС, отбирали водную фазу, добавляли к ней равный объем
изопропанола и осаждали РНК центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин
при 4оС (Chomczynski and Sacchi, 1987).
ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
1 г печени стерляди, замороженной в жидком азоте, растирали в тонкий
порошок и гомогенизировали в 15 мл раствора, содержащего 0,5 М Na2ЭДТА, рН
8,0, 0,5% саркозила, 100 мкг/мл протеиназы К и нагретого до 65оС. Затем
инкубировали при 50оС течение 3 часов при легком покачивании. Затем,
избегая резких встряхиваний, экстрагировали ДНК равным объемом фенола три
раза, каждый раз разделяя фракции центрифугированием при 4000 g и комнатной
температуре. Фенол предварительно очищали перегонкой и насыщали буфером,
содержащим 1 М трис-HCl, один раз и два раза буфером, содержащим 0,1 М трис-
HCl и 0,1% 2-меркаптоэтанол. Диализ ДНК проводили при 10оС в течение 12
часов против 4 л буфера, имеющего состав:
50 мМ трис-HCl, рН 8,0,
10 мМ Na2ЭДТА,
10 мМ NaCl.
Затем обрабатывали пробу РНКазой, свободной от ДНКазы,при 37оС в
течение 1 часа в концентрации 100 мкг/мл. После этого экстрагировали ДНК
равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) два раза и проводили диализ при
10оС в течение 36 часов против 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ
Na2ЭДТА, рН 7,5), меняя буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др., 1984).
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК
Выделение поли(A)+РНК.
Для ингибирования РНКазы все растворы, не содержащие трис,
обрабатывали 0,1% диэтилпирокарбонатом 12 часов при 37оС и автоклавировали.
Посуду прокаливали при 250оС в течение 4 часов. Поли(A)+РНК выделяли из
суммарной РНК лейкоцитов стерляди методом хроматографии на олиго(dT)-
целлюлозе. Для этого РНК растворяли в воде, прогревали при 65оС в течение 5
мин, добавляли равный объем 2-кратного буфера для нанесения РНК (40 мМ трис-
HCl, рН 7,6, 1 М NaCl, 2 мМ Na2ЭДТА, 0,2% SDS) и трижды пропускали через
колонку с олиго(dT)-целлюлозой. Затем промывали колонку 5-10 объемами
буфера для нанесения и 4 объемами этого же буфера, содержащего 0,1 М NaCl.
После этого элюировали поли(A)+РНК в 2-3 объемах воды, обработанной
диэтилпирокарбонатом, добавляли 2,2 объема этанола и осаждали
центрифугированием в течение 10 мин при 12000 g при 4оС (Маниатис и др.,
1984).
Синтез кДНК.
Синтез кДНК проводили в соответствии с протоколом фирмы Stratagene.
По матрице поли(A)+РНК синтезировали первую цепь кДНК (рис. 9).
Реакционная имела состав:
5 мкл 10-кратного буфера для синтеза первой цепи,
3 мкл смеси метил-dНTФ,
2 мкл раствора праймер-линкера (1.4 мкг/мкл),
1 мкл ингибитора РНКазной активности,
1.5 мкл фермента обратная транскриптаза (50 е.а./мкл),
вода до суммарного объема 50 мкл.
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1 часа. Затем охлаждали до 0оС
и добляли компоненты для синтеза второй цепи кДНК:
20 мкл буфера для синтеза второй цепи,
6 мкл смеси dНTФ,
88,9 мкл стерильной воды,
2 мкл 32Р-dНTФ (800 Ки/мМ),
2 мкл раствора РНКазыH (1.5 е.а./мкл),
11.1 мкл ДНК полимеразы I.
Смесь инкубировали при 16оС в течение 2,5 часов, затем охлаждали до
0оС и добавляли компоненты для застройки “липких” концов:
23 мкл смеси дНTФ,
2 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 е.а./мкл).
Смесь инкубировали при 72оС в течение 30 мин.
Затем проводили экстракцию равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и
равным объемом хлороформа, после чего отбирали водную фазу, добавляли 20
мкл 3М NaAc и 400 мкл 96% этанола и осаждали кДНК центрифугированием при
12000 g в течение 12 мин.
Сшивка молекул кДНК с вектором.
кДНК растворяли с EcoR I адапторами (рис. 9) и инкубировали при 4оС в
течение 30 мин. Затем добавляли компоненты для сшивки молекул адапторов и
молеул кДНК:
праймер-линкер
5' CTCGAGTTTTTTTTTTTT 3'
3' AAAAAAAAAAAA 5'
поли(A)+РНК
Xho I сайт 1-я цепь EcoR I адаптор
5' р-TCGAGTTTTTTTTTTTT,,,,,,,,CTCGTGCCG-р 3'
3' р-CAAAAAAAAAAAA GAGCACGGCTTAA-р 5'
2-я цепь
Xho I сайт кДНК EcoR
I сайт
5' CTCGAGTTTTTTT,,,,,,,,,CTCGTGCCGAATTC 3’
3' GAGCTCAAAAAAA GAGCACGGCTTAAG 5’
ДНК вектора
ДНК вектора
Рис. 9. Схема синтеза кДНК по матрице поли(A)+РНК и сшивки с
плазмидным вектором
pBluescript KS(+) по сайтам EcoR I и Xho I.
Обозначения:,,,,, - метилированная цепь кДНК,
-неметилированная цепь кДНК.
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
1 мкл 10 мМ рATФ,
1 мкл фермента ДНК лигазы фага Т4 (4 е.а./мкл).
Смесь инкубировали при 4оС в течение 2-х суток, после чего
инактивировали лигазу прогреванием при 70оС в течение 30 мин, охлаждали до
комнатной температуры и добавляли компоненты для фосфорилирования концевых
нуклеотидов:
1 мкл 10-кратного буфера лигирования,
2 мкл 10 мМ рATФ,
6 мкл стерильной воды,
1 мкл фермента полинуклеотидной киназы фага Т4 (10 е.а./мкл).
Реакционную смесь инкубировали при 37оС в течение 30 мин. Затем
охлаждали до комнатной температуры и добавляли компоненты для образования
липких концов по сайту рестрикции эндонуклеазы Xho I:
28 мкл буфера 4,
3 мкл Xho I (40 е.а./мкл).
Смесь инкубировали при 37оС в течение 1,5 часа. Затем добавляли 5 мкл
10-кратного буфера STE (1 М NaCl, 200 мМ трис-HCl, рН 7,5, 100 мМ Na2ЭДТА)
и пропускали через колонку с гелем сефакрил С-500. Фракции, содержащие
молекулы с размером более 500 пн объединяли и экстрагировали ДНК равным
объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) и равным объемом хлороформа. Затем
добавляли двойной объем этанола, осаждали кДНК центрифугированием,
промывали 80% этанолом и растворяли в 10 мкл воды. Для лигирования брали 5
мкл раствора кДНК (600 нг) и 2 мкл раствора вектора pBluescript KS(+) (1
мкг), имеющего "липкие" дефосфорилированные концы по сайтам рестрикции
эндонуклеазами EcoR I и Xho I (рис. 9).
Затем добавляли 1 мкл 10-кратного буфера 3, 1 мкл 10 мМ раствора рATФ и 1
мкл фермента лигазы фага Т4 (4 е.а./мкл). Смесь инкубировали при 4оС в
течение 2-х суток, после чего экстрагировали равными обьемами фенол-
хлороформа и хлороформа.
Амплификация библиотеки.
Электротрансформацию проводили как описано в п. Трансформация
прокариотических клеток, после чего высевали 1/1000 объема (2,5 мкл) среды
SOC на селективную среду с ампициллином (50 мкг/мл) для определения
количества трансформированных клеток. Остальную часть помещали в 100 мл
среды LB с ампициллином (50 мкг/мл) и инкубировали при 37оС при
перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность не достигнет величины
D550=2-2,5. Затем отбирали 1,6х1011 клеток, осаждали их центрифугированием,
суспендировали в 4 мл среды LB и перемешивали с 4 мл глицерина. Полученную
библиотеку хранили при -70оС.
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
Реакционная смесь полимеразной цепной реакции (ПЦР) содержала
следующие компоненты:
100 нг ДНК матрицы,
100 нг невырожденного праймера,
500 нг вырожденного праймера,
5 мкл 2 мМ раствора дНTФ,
5 мкл 1-кратного буфера (10 мМ трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl2,
0,001% желатин),
1 мкл Taq полимеразы,
вода до конечного объема 50 мкл (Dieffenbach and Dveksler, 1995).
Температурный режим ПЦР.
Реакционную смесь инкубировали при 95оС в течение 5 мин, после чего
добавляли Taq полимеразу и использовали температурный режим, при котором в
течение первых 18 циклов температуру отжига праймеров понижали на 3оС черех
каждые три цикла:
1й-18й циклы 95оС - 1 мин (денатурация ДНК),
50-35оС - 1 мин (отжиг праймеров),
72оС - 2 мин (полимеризация).
19-й-30-й циклы: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 2 мин.
31-й цикл: 95оС - 1 мин,
50оС - 1 мин,
72оС - 10 мин.
СУБКЛОНИРОВАНИЕ ДНК
Фрагменты ДНК, полученные в результате ПЦР, разделяли в 1% агарозном
геле и выделяли как описано в п. Выделение ДНК из геля. Затем осаждали ДНК
этанолом, растворяли в 5-10 мкл воды и добавляли компоненты для удаления
выступающих нуклеотидов с 3' конца ДНК:
1 мкл 10-кратного буфера (200 мМ трис-HCl, рН 8,2, 100 мМ KСl, 60 мМ
(NH4)2SO4, 20 мМ MgCl2, 1% тритон Х-100 и 100 мкг/мл бычий сывороточный
альбумин),
1 мкл 10 мМ dНTФ,
1 мкл Pfu ДНК полимеразы (2,5 е.а./мкл),
воду до конечного объема 10 мкл.
Смесь инкубировали 30 мин при 72оС после чего охлаждали до 0оС и
добавляли компоненты для сшивки с вектором pBluescript KS(+) по сайту
рестрикции Sma I:
1 мкл расщепленного вектора (0,5 мкг),
1 мкл 10-кратного буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 7 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ),
1 мкл 10 мМ дATФ,
1 мкл ДНК лигазы фага Т4 и воду до конечного объема 10 мкл.
Смесь инкубировали одни сутки при комнатной температуре и затем
использовали для химической трансформации клеток E.coli. Трансформированные
клетки высевали на селективную среду: 1,5% LB-агар с ампициллином (50
мкг/мл), тетрациклином (15 мкг/мл), ИПТГ (2 мМ), X-Gal (500 мкг/мл) и
инкубировали 14 часов при 37оС. После этого отбирали колонии белого цвета
(Маниатис и др., 1984; Dieffenbach and Dveksler, 1995).
СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ кДНК
Библиотеку кДНК высевали на чашки Петри с 1,5% LB-агаром с
ампициллином (50 мкг/мл) из расчета 4000 колоний на чашку и инкубировали
при 37оС до тех пор пока колонии не достигнут 0,5-1 мм в диаметре. Колонии
переносили на нейлоновую мембрану и инкубировали при комнатной температуре
в денатурирующем растворе (0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl) в течение 7 мин и два
раза по 2 мин в нейтрализующем растворе (1,5 М NaCl, 0,5 М трис-HCl, рН
7,5). Затем споласкивали мембрану в 2-кратном буфере SSC (0,3 М NaCl, 0,03
М цитрат натрия), высушивали и фиксировали ДНК в течение 10 мин
ультрафиолетовым излучением с длиной волны 310 нм. После этого мембрану
помещали в 50 мл предгибридизационного раствора (раствор 1), содержащего:
6-кратный SSC (0.9 М NaCl, 0,09 М цитрат натрия),
5-кратный раствор Денхардта (0,1% бычий сывороточный альбумин, 0,1%
фикол, 0,1% поливинилпиролидон),
0,5% SDS,
10% декстран сульфат,
500 мкг денатурирированной ДНК цыпленка,
и инкубировали 1 час при 55оС. После этого добавляли меченую 32P-дATФ ДНК
зонда и инкубировали 12-18 часов при 55оС при постоянном покачивании.
После гибридизации проводили промывание мембраны два раза по 10 мин в
200 мл 2-кратного SSC + 0,1% SDS при комнатной температуре, 15 мин в 1-
кратном SSC + 0,1% SDS% при 55оС и два раза по 10 мин в 0,1-кратном SSC +
0,1% SDS при 55оС. Экспонирование проводилось в течение 12 часов при -70оС
с рентгеновской пленкой (Маниатис и др., 1984).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК
Нуклеотидную последовательность ДНК определяли по методу Сэнгера
(Sanger et al., 1977). 5 мкг плазмидной ДНК, очищеной гель-фильтрацией на
колонке с биогелем П-10, денатурировали в 50 мкл 0.2 М NaOH при 37оС в
течение 30 мин, затем добавляли 5 мкл 3 М NaAc, рН 5,1, двойной объем
этанола и инкубировали 30 мин при температуре -70оС. После этого осаждали
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|
