|
сегментов; б) смещения рекомбинационной рамки при соединении V и J
сегментов. Нельзя исключить, что определенный вклад в разнообразие может
вносить соматический мутагенез. Во всяком случае, наличие этого механизма
показано для генов H-цепей лягушки (Zezza et al., 1992).
ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ
Согласно наиболее популярной в настоящий момент гипотезе гены ИГ и Т-
клеточных рецепторов произошли от одного предкового гена, кодировавшего
один домен путем различных вариантов последовательных дупликаций (рис. 7).
В эволюции генов ИГ можно выделить три основных события.
1. Разделение предкового V-подобного гена на V и J сегменты и
возникновение механизма генерации разнообразия путем соматической
рекомбинации. Предпологается, что это событие связано с внедрением
транспозона в предковый ген и осуществилось до разделения ИГ и Т-клеточных
рецепторов у предков хрящевых рыб (Gilbert, 1990). Наличие в геноме акул и
скатов слитых VJ генов в локусах L-цепей классов I и II, является, по-
видимому, вторичным событием и, возможно, обусловлено фиксацией генов,
кодирующих антитела строго определенной специфичности (Anderson et al.,
1995).
2. Возникновение механизмов соматического мутагенеза генов ИГ. У
млекопитающих соматический мутагенез обеспечивает как минимум половину
разнообразия антител, являясь основой аффинного созревания антител при
вторичном иммунном ответе (Пол, 1987). Достаточно выражен соматический
мутагенез также у птиц (Thompson and Neiman, 1987; Reynaund et al., 1987).
Ряд данных позволяет предполагать, что соматический мутагенез может
осуществляться у хрящевых рыб и у амфибий, но эти результаты нуждаются в
более тщательном изучении. В частности, у хрящевых рыб получение
достоверных свидетельств затруднено наличием множественых кластеров генов,
что не позволяет надежно соотносить данные по геномной структуре и
структуре кДНК (Litman et al., 1993).
3. Переход от кластерной к сегментарной организации генных сегментов.
Сегментарная организация может иметь несколько преимуществ. Во-первых,
увеличивается разнообразие продуцируемых антител за счет дополнительных
возможностей комбинирования разных V и J сегментов. Во-вторых, уменьшается
размер локуса за счет
Рис. 7. Гипотетическая схема эволюции структурной организации локусов
генов L-цепей ИГ позвоночных. (Anderson et al., 1995; Gilbert, 1990).
Обозначения: - сигнальные олигомеры, фланкирующие V и J сегменты.
резкого сокращения количества C генов. В-третьих, подобная организация
позволяет упростить регуляцию экспрессии различных локусов.
Ключевым принципом функционирования иммунной системы является принцип
клональной селекции иммунокомпетентных клеток, несущих рецептор
определенной специфичности. Ряд косвенных данных позволяет считать, что у
акул гуморальный иммунный ответ клонально ограничен (Shankey and Clem,
1980). Однако неизвестно, каким образом и насколько эффективно
осуществляется это ограничение (Flajnik, 1996). У млекопитающих принцип
“одна клетка - одно антитело” обеспечивается благодаря изотипическому и
аллельному исключению. При сегментарной организации генов продуктивная
перестройка в одном из локусов ведет к блокированию перестройки других
локусов и, тем самым к их инактивации. Однако, в случае наличия
множественных VJC кластеров, в части из которых VJ сегменты слиты в
зародышевой ДНК, механизмы контроля выборочной экспрессии могут быть более
сложными или не столь эффективными. Таким образом, переход от кластерной к
сегментарной форме организации генов ИГ мог иметь принципиальное значение
для формирования полноценной системы гуморального иммунитета.
Вопрос о том, на каком этапе филогенеза произошел этот переход
остается открытым. Уже у амфибий гены ИГ L- и Н-цепей организованы
сегментарно. При этом, в случае L-цепей наблюдается два основных типа
организации: каппа-подобный (один С ген, семейство J сегментов и семейство
V сегментов) и лямбда подобный (несколько пар JC и семейство V сегментов).
По всей видимости, различные типы L-цепей амфибий произошли от различных
типов L-цепей хрящевых рыб, однако относительно невысокая гомология по
первичной структуре не позволяет утверждать этого с определенностью
(Gilbert, 1990).
У сомика и радужной форели, представителей костистых рыб, организация
генов L-цепей и Н-цепей отличается. Гены Н-цепей костистых рыб организованы
подобно млекопитающим сегментарно (Bengten et al., 1991). Организация генов
L-цепей имеет кластерный характер. В то же время, в отличие от хрящевых
рыб, транскрипционная ориентация V генов у них изменена.
Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно
специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно (Рис.
8). Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут
представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966).
В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и
организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые
являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше
настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения
относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих
(предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И., 1941),
очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили
черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием
могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и
амфибиями.
Рис. 8. Эволюционное древо низших позвоночных ( по Северцеву А. Н.,
1939).
Обозначения: - таксоны, имеющие ныне живущих представителей, -
таксоны, существование которых доказано палеонтологическими исследованиями.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК
В агарозном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере
ТАЕ, имеющем состав: 0.04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др.,
1984).
В полиакриламидном геле.
Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0,5-кратном
буфере ТБЕ, имеющем состав: 0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 2
мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10%
раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др., 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ
Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.
Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой
ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на
диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0,5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК
(2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы
проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем
состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8,0 (Маниатис и др., 1984).
Адсорбция на кремниевой пудре.
Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали
участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М
раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой
пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300
мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После
этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и
дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ
трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с
силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995).
Замораживание - оттаивание.
Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали
центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к
супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при
12000 g в течение 10 мин.
ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ
500 нг ДНК-матрицы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при
100оС в течение 10 мин и быстро охлаждали до 0оС. Затем добавляли 10 мкл 10-
кратного буфера (40 мМ KP04 рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2 и 1,0 мМ 2-
меркаптоэтанол), 0,1-0,5 мКи 32Р-dATФ, 10 мкл 2 мМ раствора трех других
немеченых дНTФ до концентрации 200 мкМ. Объем реакционной смеси доводили
водой до 100 мкл, добавляли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12
е.а.) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку
зонда проводили методом гель - фильтрации на колонке с биогелем П-10
(Маниатис и др., 1984).
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК
Клетки Escherichia coli, выращенные в среде Луриа-Бертани (1% NaCl,
1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, рН 7,5) (среда LB) с
ампициллином (50 мкг/мл), осаждали центрифугированием при 4000 g. Затем
осадок суспендировали в буфере STET (8% сахароза, 0,5% тритон X-100, 10 мМ
трис-HCl и 50 мМ Na2ЭДТА, рН 8,0) и добавляли лизоцим до концентрации 0,8
г/мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и при
100оС в течение 1 мин. После этого клеточный дебрис осаждали
центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин.
Для осаждения плазмидной ДНК к супернатанту добавляли 1/10 объема 3 М
раствора ацетата натрия, равный объем изопропанола и центрифугировали при
16000 g в течение 15 мин при 20оС. Затем промывали осадок добавлением 80%
этанола и повторным центрифугированием в течение 5 мин при 20оС (Маниатис и
др., 1984).
ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В
ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl
На каждые 10 мл раствора плазмидной ДНК, полученного после осаждения
лизированных клеток (см. Выделение плазмидной ДНК), добавляли 1 г сухого
CsCl, соль растворяли, после чего на каждые 10 мл раствора добавляли 0,8 мл
раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. Смесь помещали в
центрифужные пробирки Beckman, заполняли доверху раствором CsCl и
бромистого этидия той же плотности и центрифугировали в роторе Ti 60 при
45000 об/мин и температуре 20оС в течение 36 часов. После этого отбирали
кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК и экстрагировали бромистый
этидий из раствора до полного обесцвечивания равным объемом н-бутанола,
предварительно насыщенного 1 М раствором NaCl.
ДНК осаждали центрифугированием при 15000 g, добавив равный объем 1 М
раствора NH4Cl и два объема этанола. После промывания этанолом осадок ДНК
растворяли в воде до концентрации 1 мкг/мкл (Маниатис и др., 1984).
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК
Химическая трансформация.
Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF ' и
выращивали в 100 мл 2-кратной среды Луриа (2% бакто-триптон, 1% бакто-
дрожжевой экстракт, 0,1% NaCl, 0,4% глюкоза, рН 7,0) при 37оС до оптической
плотности D550=0,35. Клеточную суспензию выдерживали при 0оС в течение 2
часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, температуре 4оС
и суспендировали в 50 мл ледяного буфера А (100 мМ CaCl2, 70 мМ MnCl2, 40
мМ NaAc, рН 5,5). После этого суспензию клеток выдерживали при 0оС в
течение 30 мин, после чего клетки осаждали и суспендировали в 5 мл буфера А
с 15% глицерина.
Для трансформации к 200 мкл суспензии компетентных клеток добавляли
30 нг плазмидной ДНК, растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0оС в
течение 30 мин. Затем инкубировали при 37оС в течение 5 мин, после чего
добавляли 3 мл среды LB и инкубировали при 37оС еще 90 мин. Клетки собирали
центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др., 1988).
Электротрансформация.
Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF '
выращивали в 100 мл среды LB (см. Химическая трансформация) при комнатной
температуре до оптической плотности D550=0,45. Затем клетки осаждали
центрифугированием при 4000 g, 4оС и промывали суспендированием
последовательно в 100 мл, 50 мл и 10мл 10% раствора глицерина при 0-4оС.
После этого клетки суспендировали в 240 мкл ледяного раствора GYT (10%
глицерин, 0,125% бакто-дрожжевой экстракт, 0,25% бакто-триптон).
Для трансформации к 40 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 1
мкл ДНК вектора (50 нг) при 0-4оС и пропускали электрический разряд
(U=18000 В). Затем добавляли 1 мл SOC (2% бакто-триптон, 0,5% бакто-
дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ
глюкоза), перемешивали, переносили в 3 мл среды SOC, прогретой до 42оС, и
инкубировали при 37оС в течение 1 часа (Wai Lin Tung and King-C. Chow,
1995).
ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ
Кровь собирали на холоду через каудальную артерию с добавлением на
каждые 5 мл крови 1 мл 2,7% раствора Na2ЭДТА, рН 7,4. К выделенной крови
добавляли равный объем трис-солевого буфера (TBS) (0,14 М NaCl, 5 мМ KCl,
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|
