Клонирование и анализ генов легких цепей иммуноглобулинов стерляди
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК
СОКРАЩЕНИЙ..................................................................
............................3
ВВЕДЕНИЕ....................................................................
.........................................................4
ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................
....................................5
СТРОЕНИЕ
ИММУНОГЛОБУЛИНОВ............................................................
.......................5
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У
МЛЕКОПИТАЮЩИХ...............................................................
.....7
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ
ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У НИЗШИХ
ПОЗВОНОЧНЫХ......................................................11
ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ
ИГ..........................................................................
.............19
МАТЕРИАЛЫ И
МЕТОДЫ......................................................................
.....................24
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
ДНК.........................................................................
...................................24
ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ
ГЕЛЯ........................................................................
.........................24
ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ
ЗОНДОВ......................................................................
25
ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ
ДНК.........................................................................
.............26
ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО
ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ
CsCl........................................26
ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ
КЛЕТОК...................................................27
ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ
РЫБ.................................................................28
ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ
ЛЕЙКОЦИТОВ.....................................................28
ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК
ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ
КЛЕТОК......................................................................
...............28
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ
кДНК......................................................................29
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ
РЕАКЦИЯ.....................................................................
..........33
СУБКЛОНИРОВАНИЕ
ДНК.........................................................................
..........................34
СКРИНИНГ БИБЛИОТЕКИ
кДНК........................................................................
................34
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
ДНК.............................35
САУЗЕРН БЛОТ
ГИБРИДИЗАЦИЯ................................................................
.....................36
РЕЗУЛЬТАТЫ..................................................................
...................................................38
КОНСТРУИРОВАНИЕ БИБЛИОТЕКИ кДНК И ЕЕ
СКРИНИНГ.....................................38
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ
СТРУКТУРЫ...................................................................
...40
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЕРВИЧНОЙ
СТРУКТУРЫ..............................................40
АНАЛИЗ ГЕНОМНОЙ
ОРГАНИЗАЦИИ.................................................................
.............41
ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................
..................................................46
ВЫВОДЫ......................................................................
.........................................................48
СПИСОК
ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................
..............................49
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИГ
иммуноглобулины
пн
пар нуклеотидов
тпн тысяч
пар нуклеотидов
е.а.
единица активности
ИПТГ
изопропилтиогалактозид
ТЕМЕД N,N,N,'N'-тетраметил-этилен-
диамин
трис
трис(гидроксиметил)аминометан
дНTФ
дезоксиаденозинтрифосфат
ддНТФ
дидезоксинеклеотидтрифосфат
дНТФ
дезоксинуклеотидтрифосфат
рATФ
рибоаденозинтрифосфат
ДТТ
дитиотрейтол
Na2ЭДТА этилендиаминтетраацетат
натрия
SDS
додецилсульфат натрия
X-Gal 5-бромо-4-хлоро-3-индолил-бета-D-
галактозид
ВВЕДЕНИЕ
В основе функционирования гуморального иммунитета у млекопитающих
лежит сложный комплекс молекулярно-генетических и физиологических
механизмов, обеспечивающих реорганизацию, мутагенез и клональную экспрессию
генов иммуноглобулинов. Возникновение этой подсистемы иммунитета связывают
с появлением хрящевых рыб.
На ранних этапах эволюции гены ИГ были организованы в виде
повторяющихся кластеров V-J-C генных сегментов. При подобной организации
разнообразие продуцируемых антител основывалось, прежде всего, на
количестве имевшихся в геноме кластеров, каждый из которых кодировал один
вариант полипептидных субъединиц ИГ. В ходе дальнейшей эволюции произошел
переход от кластерной к сегментарной организации, обеспечивающей
дополнительный источник разнообразия за счет комбинативной рекомбинации
генных сегментов. Предполагается, что этот переход также имел важное
значение для регуляции экспрессии генов и осуществления механизмов
клонального отбора антителопродуцирующих клеток в ходе иммунного ответа.
Настоящая работа представляет собой часть проекта, направленного на
изучение эволюции механизмов изотипического исключения генов легких цепей
ИГ у низших позвоночных. Целями работы являлись изучение структуры и
организации генов легких цепей ИГ стерляди (Acipenser ruthenus),
представителя филогенетически древней группы костно-хрящевых рыб.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
СТРОЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Иммуноглобулины выполняют в организме позвоночных функцию гуморальных
антител и антиген-связывающих рецепторов В-лимфоцитов. Особенностью этого
класса белков является огромное разнообразие, позволяющее им вступать во
взаимодействие с фактически любыми биологическими макромолекулами.
Типичная молекула ИГ состоит из двух идентичных тяжелых (H) и двух
идентичных легких (L) полипептидных цепей. H- и L-цепи построены из
нескольких доменов, каждый из которых состоит примерно из 110
аминокислотных остатков. У млекопитающих существует пять классов H-цепей:
(, m, (, (, и (. Каждая H-цепь построена из одного N-концевого и нескольких
(трех или четырех) C-концевых доменов. N-концевые домены различаются в
разных молекулах и называются вариабельными (V) доменами. C-концевые домены
имеют одинаковую структуру у молекул одного класса и называются
константными (С) доменами (рис. 1) (Пол, 1987).
Среди L-цепей млекопитающих различают два типа: лямбда и каппа.
Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного и одного константного
доменов. В индивидуальной молекуле ИГ присутствует только один тип L-цепи
(Roitt et al., 1993).
Гигантское разнообразие ИГ обеспечивается прежде всего тем, что V и C
области кодируются разными генами (генными сегментами), физически
разнесенными в зародышевой ДНК.
В формировании вариабельных доменов H-цепей участвуют три генных сегмента:
вариабельный (V), D-сегмент (от англ. diversity- разнообразие) и J-сегмент
(от англ. joining- соединяющий). С-области Н-цепей разных классов
кодируются отдельными генами (Roitt et al., 1993).
Рис. 1. Схема строения молекулы иммуноглобулина.
Типичная молекула иммуноглобулина содержит две идентичные легкие (L)
и две идентичные тяжелые (H) цепи, связанные между собой ковалентно
дисульфидными связями. Каждая L-цепь состоит из одного вариабельного (VL) и
одного константного (СL) домена. Н-цепь состоит из одного VH и нескольких
CН доменов.
В формировании зрелого гена L-цепи участвуют три генных сегмента: V-
сегмент и J-сегмент кодируют V-домен, C-сегмент кодирует константный домен.
На поздних стадиях развития В-лимфоцита генные сегменты, кодирующие
вариабельные домены, объединяются в различных сочетаниях, образуя матрицу
для экспрессии L- и H-цепей (Seidman et al., 1979; Durdik et al., 1984).
ГЕНОМНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ L-ЦЕПЕЙ ИГ У МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Различные виды млекопитающих имеют сходную схему организации и
экспрессии генов ИГ. Одним из наиболее изученных в этом отношении видов
является человек. Лямбда и каппа цепи ИГ у человека кодируются генами,
расположеными в разных локусах и на разных хромосомах. Каппа локус состоит
из большого количества V( генных сегментов, собраных в группы, пяти J( и
одного С( сегмента.. Такой тип организации называется сегментарным (рис.
2). Лямбда локус состоит из группы V( сегментов, точное количество которых
неизвестно, и семи пар J(-C( сегментов. Три из них (JC(4 - JC(6) являются
псевдогенами (Hieter et al., 1981; Roitt et al., 1993).
В процессе развития В-лимфоцита в кроветворных органах один из V
сегментов соединяется с одним из J сегментов посредством сайтспецифической
рекомбинации (Schatz et al., 1992). В этот процесс вовлекаются специальные
олигомерные последовательности: гепта- и нонамеры, фланкирующие с 3'
стороны V сегмент и с 5' стороны J сегмент (рис. 3) (Aguilera et al., 1987;
Hesse et al., 1989). Отличительной особенностью лямбда и каппа локусов
является конфигурация промежутков между гепта- и нонамерами, называемых
спейсерами. С V и J генными сегментами лямбда типа ассоциированы 23 пн и 12
пн спейсеры соответственно, а с V и J сегментами каппа типа - 12 пн и 23 пн
спейсеры (Durdik et al., 1984; Stavnezer et al., 1985).
л
Рис. 2. Схема строения лямбда и каппа локусов генов L-цепей ИГ
человека.
Лямбда локус содержит много V( сегментов и семь пар
близкорасположенных J(-C(. Три из них яляюся псевдогенами ((). Каппа локус
содержит много V( пять J( и один C( генный сегмент (Hieter et al., 1981;
Roitt et al., 1993).
Обозначения: - сигнальные олигомеры.
Рис. 3. Схема расположения олигонуклеотидных последовательностей,
задействованных в сайтспецифической рекомбинации в каппа локусе
млекопитающих. Эти последовательности фланкируют с 3‘ стороны VL сегмент и
с 5’ стороны JL сегмент. Во время рекомбинации гептамер и нонамер одного из
VL сегмента объединяются с гептамером и нонамером одного из JL сегмента.
Это делает возможным соединение VL и JL сегментов без нарушения рамки
трансляции (Aguilera et al., 1987; Hesse et al., 1989).
Обозначения: - сигнальные олигомеры.
Последовательность, в которой рекомбинируют локусы L-цепей, строго
упорядочена во времени. Показано, что первыми перестраиваются локусы каппа
типа, причем если в одной хромосоме перестройка оказалась нефункциональной,
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|
