изобестическая точка зонда Фура -2, т.е. флуоресцентный сигнал при возбуждении

светом этой длины волны не зависит от концентрации Ca2+ и есть

функция лишь концентрации зонда.

Измерение флуоресценции при возбуждении двумя длинами волн позволяет легко

рассчитать [Ca2+]i в клетке по формуле (24):

[Ca2+]i= Kd * b * (R - Rmin)/(Rmax-R)

где Кd - константа диссоциации комплекса Фура -2 с кальцием, R=F

360/F390 - текущее отношение флуоресцентных сигналов, Rmin

= F360/F390|Ca0 - то же отношение в растворе с низкой

концентрацией Ca2+, Rmax = F360/F390

|CaҐ - то же отношение в растворе с высокой концентрацией Ca2+

, b = F390|Ca0/F390|CaҐ - отношение

флуоресцентных сигналов в низкой и высокой концентрации Ca2+ при

возбуждении длиной волны 390 нм. Параметры Rmin, Rmax и b

определяли экспериментально. Для этого были приготовлены базовый раствор (в

ммоль/л) : KCl - 100, Tris-Cl - 10 (pH=7.2), Фура -2 - 0.005; раствор с низкой

концентрацией Ca2+ готовился без добавления Ca2+ с

добавкой EGTA - 10; раствор с высокой концентрацией Ca2+ - с

добавкой CaСl2 - 10. Отношение величин флуоресценции определялось в

каплях приведенных выше растворов, помещенных на дно экспериментальной камеры.

В результате для нашей системы Rmin= 0.33, Rmax= 8.9 и

b=12.8. Параметр Кd был взял из работы [Grinkiewicz et al, 1985] и

равнялся 224 нмоль/л.

3.3 Окраска срезов флуоресцентным красителем

Для введения кальций - чувствительного зонда в клетку, срезы инкубировались в

растворе Тироде, содержащим эстерифицированную незаряженную форму красителя

Фура-2 ацетоксиметилэстер в концентрации 5 мкмоль/л, растворенную в

диметилсульфоксиде с добавлением детергента Плуроник F-127 (0.02%). В такой

форме краситель проникает в клетку, затем эндогенными эстеразами эфирные группы

отщепляются, зонд становится заряженным и покинуть клетку не может. Окраска

производилась 20 минут при температуре 35оС. Концентрация зонда в

клетке определялась путем титрования окрашенных клеток раствором красителя,

который добавлялся во внеклеточный раствор. Оцененная таким способом

концентрация зонда в клетке была в диапазоне 30 - 70 мкмоль/л.

3.4 Структура экспериментальной установки для двух-волнового измерения

концентрации кальция

Принципиальная схема установки представлена на рисунке 4. Основными

элементами ее являются: источник света, система смены фильтров, микроскоп,

ФЭУ, модуль предварительной обработки сигнала и компьютер.

Источником возбуждающего света служит ртутная лампа мощностью 50 ватт. Поскольку

в качестве кальций - чувствительного зонда использовали индикатор Фура -2 АМ,

являющийся по возбуждению двухволновым (см. выше), то для количественного

определения [Ca2+]i необходимо было одновременно

индуцировать флуоресценцию обеими длинами волн. В нашей конфигурации

периодическая смена фильтров возбуждения была реализована при помощи вращения

колеса с вмонтированными в него двумя интерференционными фильтрами 360 и 390

нм. Частота вращения была 5 Гц. Управление системой смены фильтров

осуществлялось при помощи кальций - измерительного модуля фирмы Luigs und

Neumann, Германия. Этот же модуль являлся интерфейсом предварительной

обработки.

Оптическая часть установки была смонтирована на базе микроскопа Axioskop,

Zeiss. Разделение потоков возбуждающего света и флуоресценции производилось

при помощи дихроического зеркала. Свет, прошедший через фильтр для

возбуждения флуоресценции, отклонялся дихроическим зеркалом и при помощи

высокоаппертурного иммерсионного объектива (40*, апертура 0.75) фокусировался

на объекте. Флуоресцентный свет проходил через соответствующий

интерференционный фильтр и подавался на фотоэлектронный умножитель (ФЭУ). Для

уменьшения уровня шумов фиксированная диафрагма (1 мм) была расположена перед

ФЭУ. В результате флуоресцентный сигнал собирался с фокальной плоскости

диаметром 50 мкм, что позволило значительно улучшить соотношение сигнал/шум.

Модуль предварительной обработки позволял производить компенсацию

автофлуоресценции и, при необходимости, усиливать сигнал, после чего он

оцифровывался при помощи цифрового интерфейса TIDA и обрабатывался

компьютером при помощи программ Tida 5.0 и Wintida, разработанных в

Гейдельберге, Германия.

Рисунок 4. Принципиальная схема экспериментальной установки для двухволнового

измерения кальция.

3.5 Растворы и смена растворов

При работе со срезами все растворы готовились на основе раствора Тироде (в

ммоль/л): NaCl - 125, KCl - 5.4, MgCl2 - 1, CaCl2 - 2.5,

NaHCO3 - 26, KH2PO4 - 1.6, глюкоза - 10,

постоянно аэрировавшийся газовой смесью 95% О2 + 5% СО2

(pH=7.4). Бескальциевый раствор готовился эквимолярной заменой CaCl2

на MgCl2 и добавкой 1 ммоль/л EGTA, растворы с повышенным содержанием

калия или кофеина - заменой NaCl на соответствующее количество KСl или кофеина.

Смена растворов производилась протоком, скорость которого можно было

варьировать от 10 до 20 мл/мин. Объем экспериментальной камеры составлял 0.5

мл. Все эксперименты были проведены при температуре (32 °С).

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Аппликация АТФ в большинстве нейронов моторной коры (98 из 102) вызывает быстрое

и кратковременное повышение концентрации цитозольного кальция [Ca2+]

i . Концентрация [Ca2+]i достигает своего максимума

на протяжении 6-8 секунд и затем восстанавливается до базального уровня при

продолжающемся присутствии АТФ. Отмывание АТФ приводит к восстановлению [Ca

2+]i до уровня покоя. Характерный вид АТФ - индуцированного

кальциевого транзиента представлен на рисунке 5.

Амплитуда АТФ - индуцированного кальциевого транзиента варьировалась в пределах

от 50 до 450 нМ. Среднее значение выброса [Ca2+]i

вызванного приложением АТФ в концентрации 100 мкМ находилось в пределах 200-250

нМ.

Наблюдалась доза - зависимость амплитуды ответа от концентрации АТФ в

пределах от 10 до 2000 мкМ. На рисунке 7 представлена апроксимация

экспериментальных точек сигма - функцией. Концентрация АТФ, при которой

амплитуда ответа составляет половину максимальной, - 220 ± 20 мкМ.

Целью наших исследований было определение подтипов пуринорецепторов вовлеченных

в генерацию [Ca2+]i транзиента. Известно, что АТФ

активирует несколько типов пуринорецепторов, а именно Р2

пуринорецепторы подтипов Р2х и Р2у (Peter Illes et al,

1993, Burnstock and Kennedy 1985), а также Са2+ каналы плазмалеммы

(Кришталь, 1983).

С целью обеспечения достоверности полученных данных, принимая во внимание тот

факт, что работа проводилась на тонких срезах мозга, мы провели серию

экспериментов с подавлением распостранения потенциалов действия с помощью

тетродотоксина (TTX). При использовании TTX выяснилось, что амплитуда и форма

[Ca2+]i транзиентов не изменяется или изменяется

незначительно. Полученные результаты позволяют нам предполагать, что получаемые

нами данные отображают процессы происходящие в отдельной наблюдаемой клетке. К

сожалению мы не имели возможности проводить все эксперименты c тетродотоксином

из-за дороговизны препарата. Для изучения характеристик рассматриваемых

пуринорецепторов, принимающих участие в генерации [Ca2+]i

транзиента, применялись следующие протоколы экспериментов.

1. Приложение АТФ в растворе не содержащем Ca2+. Удаление кальция из

внеклеточного раствора незначительно влияло на кальциевый транзиент, вызванный

аппликацией 10 мкМ АТФ, но в тоже время подавляло на 45% ± 7% кальциевый

транзиент вызванный 100 мкМ АТФ. (Рис. 8).

1. Для исследования способности внутриклеточного Ca2+ депо к

перезаполнению мы последовательно апплицировали АТФ несколько раз с интервалом

в 60 секунд в обычном растворе и в растворе не содержащем Ca2+ . Как

видно из рисунка 9 вторая аппликация АТФ вызывала Ca2+ транзиент

меньшей (на 30% ± 4%) амплитуды по сравнению с первой (контрольной)

аппликацией. Последующие аппликации АТФ разделенные 60 ти секундным интервалом

не вызывали заметного уменьшения амплитуды [Ca2+]i

транзинета по сравнению со второй аппликацией в стандартном растворе

В бескальциевом растворе - наоборот, вторая аппликация АТФ вызывала значительное

уменьшение Ca2+ транзиента на 40% ± 5% от контроля. Последующие

аппликации АТФ в бескальциевом растворе приводили к последовательному

уменьшению амплитуды [Ca2+]i транзиента и после двух -

трех последовательных аппликаций сигнал исчезал вообще (рисунок 10). Такое

уменьшение вероятно обусловлено истощением внутриклеточных депо.

1. Ингибирование захвата Ca2+ эндоплазматическим ретикулом

тапсигаргином (спецефическим блокатором Ca2+ насоса

эндоплазматического ретикулума) уменьшало [Ca2+]i

транзиенты, вызванные приложением АТФ, на 63% ± 5% для концентрации АТФ 100 мкМ

АТФ (рис. 11). Как видно из рисунка 11 приложение тапсигаргина не влияло на

базальный уровень Ca2+ в клетке.

1. Приложение кадмия в концентрации 50 мкМ, верапамила в концентрации 100 мкМ и

50 мкМ никеля обратимо уменьшало амплитуду [Ca2+]i

транзиента вызванного приложением 100 мкМ АТФ на 35%, 20%, и 15% сответственно.

Данные представлены на рисунке 12.

1. Приложение различных агонистов пуринорецепторов вызывало различные по

амплитуде ответы. Порядок относительной активности лигандов для данного объекта

был следующим ATPgS > ATФ = AДФ >> a,b-methylene ATP » AMФ >

УТФ>> аденозин (ADO), данные преставлены на рисунке 13.

1. Сурамин, известный антагонист Р2 типа пуринорецепторов, уменьшал

[Ca2+]i транзиенты, вызванные приложением 100 мкМ АТФ на

76% ± 7% и также не изменял концентрацию [Ca2+]i в

покое. Данные представлены на рисунке 14.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5