NECA к Р1 пуринорецептору, - высокого в стриатуме (А2а) и

низкого в фибробластах (А2b) (Bruns et al 1986).

2.2.4 Р2 пуринорецепторы

Накопленные фармакологические доказательства, как-то: тип ответа, порядок

активности агонистов, десенситизация, вызываемая АТФ и ее структурными

аналогами, послужили основой для первого субделения Р2

пуринорецепторов. В 1985 году Бернсток и Кеннеди (10) указали на неоднородность

популяции Р2-пуринорецепторов. Этот вывод был сделан исходя из того,

что в некоторых тканях (например продольная мышца слепой кишки) АТФ вызывал

расслабление гладких мышц, а в других (мышечная стенка мочевого пузыря) -

сокращение. Первый подтип рецепторов был обозначен как Р2у, а второй

- Р2х. Для Р2х пуринорецепторов наиболее активным

агонистом был a, b - метилен АТФ (a,b-мАТФ), а для Р2у - 2 -

метилтио АТФ (2-МеSАТP). Так как порядок активности лигандов может зависеть от

скорости их гидролиза до неактивных соединений, которая может значительно

различаться в зависимости от ткани, более четким доказательством для

подразделения Р2 - рецепторов на подтипы служит наличие селективных

блокаторов. Сейчас известны селективные антагонисты как для Р2х, так

и Р2у-рецепторов для Р2х - a,b-мАТФ (десенситизирующее

действие), арилазидаминопропионил АТФ (АНАПП3),

пиридоксалфосфат-6-азофенил-2’,4’-дисульфидная кислота (PPADS), сурамин и

другие; для Р2у пуринорецепторов - реактив голубой 2, сурамин. В

1986 году Гордон (23) предложил выделить из класса Р2

пуринорецепторов еще два подтипа Р2t и Р2z.

Первый рецептор располагается в тромбоцитах и управляет их агрегацией. Он, в

отличие от всех остальных подтипов P2 - рецепторов, активируется

АДФ, и блокируется АТФ. Р2z рецепторы расположены в

тучных клетках. В них АТФ в очень больших концентрациях (> 100 мкМ), а

точнее четырехзарядный анион АТФ4-, вызывал кальцийзависимую

секрецию гистамина. Другие пуриновые нуклеотиды, включая негидролизуемые

аналоги АТФ, не активировали рецептор. Также был обнаружен неселективный

антагонист данного типа рецепторов DIDS - аналог PPADS (Soltoff et al 1993). В

1991 году O’Connor предложил так называемый нуклеотидный рецептор одинаково

чувствительный как к АТФ, так и к УТФ, но не чувствительный к 2 - MeSATP. Этот

рецептор получил обозначение Р2u. Возможным антагонистом

данного рецептора является сурамин. Также было обнаружено, что аденин

динуклеотид полифосфаты также присутствуют в фармакологической периферии (Hoyle

1990). Hildermann (1991) индентифицировал сайт связывания для диаденозин

тетрафосфата ( Ap4A) в мозге крысы, который получил название

дипуринергического рецептора, а позднее Р2d (Pintor et al

1993). Антагонисты данного вида пуринорецепторов пока не обнаружены.

Таблица 1. Классическая схема субклассификации пурино-рецепторов.

2.2.5 Реклассификация пуринорецепторов.

Из - за всевозрастающих трудностей и несогласований в классической схеме

классификации Ð2 пуринорецепторов и увеличивающемся числе

подтипов рецепторов, стало очевидным, что классическая схема требует

пересмотра. В 1994 году Abbracchio and Burnstock предложили новую схему

классификации Р2 - пуринорецепторов. Из всех Р2 -

пуринорецепторов они вычленили три основных семейства: Р2Х семейство, связанное

с ионотропными каналами, которое включало четыре подтипа; Р2У - связанное с

активацией G - белков, включающее семь подтипов и семейство Р2Z - семейство

неселективных пор. Их гипотеза основывалась в основном на изучении литературных

источников и анализе фармакологического профиля новообнаруженныж агонистов. В

дальнейшем теория подтвердилась клонированием различных подтипов Р2

- пуринорецепторов. В настоящее время семейство Р2Х насчитывает шесть, а Р2У -

семь подклассов. Благодаря интенсивным исследованиям, практически не остается

сомнений в том, что данные семейства будут расти и дальше (Collo et al 1996).

Таблица 2. Современная классификация Р2 типа пуринорецепторов.

3. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Подготовка препарата

Исследования проводились на пирамидальных нейронах моторной области новой коры в

тонких срезах мозга, выделенного из 14 дневных крыс. После декапитации мозг

помещался в холодный солевой раствор (0 - 40С). Процедура от начала

декапитации до выделения мозга длилась не более 60-90 секунд. Затем мозг

закреплялся полиакриламидным клеем на подложке вибротома (Campden, Campden

Instruments LTD, U.K.); камера вибротома заливалась холодным солевым раствором.

Срезы нарезались сагитально толщиной 250 - 300 мкм; скорость подачи лезвия - 1

см/с с частотой 10 Гц. После приготовления срезы помещались в раствор постоянно

насыщаемый карбогеном (5% СО2 + 95% О2). Перед загрузкой

флуоресцентным красителем срезы инкубировались в постоянно оксигенируемом

растворе 30 минут при температуре 32 градуса. Окраска среза осуществлялась в

течении 30 - 35 минут в СО2 насыщенном термостате при температуре 35

градусов. После окраски срезы отмывались 1 - 1,5 часа в постоянно

оксигенируемом растворе при комнатной температуре. Все эксперименты проводились

при температуре 32 градуса.

3.2 Характеристики кальциевого зонда

Для количественного определения концентрации кальция в пирамидальных нейронах

моторной области новой коры использовался краситель Фура-2 AM (рисунок 2)

(16).

На рисунке 3 представлен спектр зонда Фура -2 AM. При связывании с кальцием

происходит характерное изменение спектра возбуждения этого красителя: при

возбуждении светом с длиной волны 390 нм происходит уменьшение флуоресценции, а

при возбуждении светом, с длиной волны 340 нм - увеличение. Однако, 340 нм

является уже ультрафиолетовым светом, и для ее использования необходим

микроскоп с кварцевыми линзами. Поскольку в нашем случае был использован

обычный микроскоп, то вторая волна была выбрана длиной 390 нм. 360 нм - это

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5