|
молибдена стойкий окрашенный комплекс.
Ход определения: Реакция запускается добавлением 0,1 мл сыворотки
крови к 2 мл 0,03 % раствора перекиси водорода. В холостую пробу вместо
сыворотки вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Реакцию останавливают через
10 минут добавлением 1 мл 4% молибдата аммония. Интенсивность окраски
измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм против контрольной
пробы, в которой вместо перекиси водорода вносят 2 мл воды.
Расчет: [pic] (мкат/л), где
Е – активность каталазы в мкат/л;
А – оптическая плотность холостой и опытной проб;
V – объем вносимой пробы, 0,1 мл;
t – время инкубации, 600 сек;
К – коэффициент миллимолярной экстинкции перекиси водорода, равный [pic].
За единицу активности каталазы принимают то количество фермента,
которое участвует в превращении 1 мкат перекиси водорода за 1 секунду при
заданных условиях. Расчет активности каталазы ведут на 1 л сыворотки крови.
Пример расчета: больной Крайнов Т.В., 31 год.
[pic]
[pic]
[pic] (мкат/л)
2.2.3. Определение общего холестерина в сыворотке крови ферментативным
методом «Фотокол»
(Творогова М.Г., 1995)
Определение основано на сопряженных реакциях, которые катализирует
холестеринэстераза, холесериноксидаза и пероксидаза:
Эфиры холестерина [pic] холестерин + Ж.К.;
Холестерин + О2 [pic] холестинон + Н2О2;
Н2О2 + хромогены [pic] Н2О + окрашенный продукт.
Концентрация образующегося в ходе реакции окрашенного продукта
пропорциональна концентрации холестерина в пробе.
Ход определения: Рабочий реагент обязательно вносить в пробирки после
проб, содержащих холестерин. Пробирки встряхнуть и инкубировать при t =
37oС. Через 10 минут после начала инкубации пробирки повторно встряхнуть и
инкубировать 20 минут при t = 37oС. Окрашенные пробы фотометрировать при
500 нм в кювете с длиной оптического пути 5 мм или 10 мм относительно
холостой пробы. Окраска стабильна в течении двух часов при комнатной
температуре.
Концентрацию холестерина в исследуемых пробах рассчитать по формуле:
[pic] ммоль/л, где
ЕОП и ЕК – оптические плотности исследуемой пробы и пробы с калибратором.
Норма: 3,62 – 5,2 ммоль/л.
2.2.4. Определение циркулирующих иммунных комплексов
в крови методом ПЭГ-теста (Гриневич Ю.А., 1988)
Метод основан на селективной преципитации комплексов АТ-АГ в 3,75 %
ПЭГ (полиэтиленгликоля) с последующим определением плотности преципитата.
Реактивы:
1) 0,1 м боратный буфер (3,410 г борной кислоты, 4,275 г буры
растворить в 1 л дистиллированной воды)
2) 10 г полиэтиленгликоль – 6000 ед. растворить в 240 мл буфера.
Ход определения: К 0,3 мл сыворотки крови добавить 0,6 мл реактива
№1, перемешать и перенести по 0,3 мл в 2 пробирки. В I добавить 2,7 мл
раствора №1 (контроль). Во II добавить 2,7 мл раствора №2 (опыт).
Перемешать, инкубировать в течение 60 минут при комнатной температуре. На
спектрофотометре (КФК-3) определяют оптическую плотность в кюветах [pic]
при 450 нм.
Расчет: Высчитывают разность показателей оптической плотности,
результат умножают на 1000 и получают количество ИК в 100 мл сыворотки.
Ответ выражают в единицах оптической плотности. [pic] - количество ЦИК в
100 мл сыворотки.
Норма: 54,24 + 2,03 усл. ед.
Пример расчета: больной Максимов С.И., 19 лет.
[pic]
[pic]
Количество ЦИК в 100 мл сыворотки:
[pic] усл. ед.
2.2.5. Определение уровня МСМ в крови (Габриэлен Н.И., 1984)
Метод основан на осаждении белков из исследуемой жидкости 10 %
раствором ТХУ с последующем центрифугированием и определением абсорбции
света супернатантом в 10 раз разведенным дистиллированной водой.
Ход работы: Сыворотку крови обрабатывают 10 % раствором ТХУ. В
качестве контроля лучше использовать сам раствор ТХУ в 30 раз разведенный
дистиллированной водой. Оптическая плотность его против воды составляет
0,123(0,012 усл. ед. на волне 254 нм при 23-25[pic]С. Центрифигируем 3000
об/мин в течение 30 минут. К 0,5 мл надосадочной жидкости +4,5 мл
дистиллированной воды. Измерение проводим на спектрофотометре в УФ свете
при 280 нм для определения ароматических аминокислот и при длине волны 254
нм для определения нуклеотидов. Уровень МСМ выражают в единицах,
количественно равных показателям экстинции.
2.2.6. Определение показателей «эффективная концентрация
альбумина» и «общая концентрация альбумина» в сыворотке крови человека
флуоресцентным методом
(Миллер Ю.И., 1994).
Принцип метода:
Метод основан на специфическом взаимодействии флуоресцентных
органических соединений с альбумином в сыворотке крови. В зависимости от
условий этого взаимодействия интенсивность флуоресценции красителя из
альбумина отражает различные свойства белка. Индекс ЭКА/ОКА не зависит от
числа молекул альбумина в пробе и характеризует физико-химические свойства
молекулы альбумина.
Состав набора:
Реактив I (4 ампулы по 5 мл). Предназначен для приготовления раствора
используемого при разбавлении сыворотки крови. Он содержит антикоагулянт
ЭДТА.
Реактив II (4 ампулы по 0,7 мл). Основным компонентом является
специальное флуоресцирующее соединение, интенсивность флуоресценции
которого в сыворотке крови пропорциональна концентрации сывороточного
альбумина.
Реактив III (4 ампулы по 0,7 мл). Взаимодействие реактивов №2 и №3 с
сывороткой позволяет определить ОКА.
Определение показателя ЭКА:
К 2,0 мл надосадочной жидкости добавить 0,025 мл реактива 2.
Перемешать. Измерить интенсивность флуоресценции при длине волны
возбуждения 420 нм и длине волны испускания 515 нм.
Определение показателя ОКА:
В ту же пробу добавить 0,025 мл реактива 3. Перемешать. Измерить
интенсивность флуоресценции. Нормальные величины показателя ЭКА лежат в
интервале нормальных значений ОКА от 40 г/л – 55 г/л.
Подготовка образцов крови к измерениям:
Буферный раствор: Содержимое ампулы с реактивом 1 перенести в 100 мл
дистиллированной воды. Перемешать. 0,025 мл сыворотки крови добавить в
пробирку, содержащую 5 мл раствора для разбавления крови. Для анализа берут
жидкость 2,0 мл полученного образца.
Используют специализированный анализатор АКЛ-0,1.
3. Результаты исследования и их обсуждение
1. Определение показателей уровня интоксикации
в сыворотке крови практически здоровых людей
Нами было произведено исследование биохимических показателей – МДА,
активность каталазы, уровень холестерина, ЦИК, МСМ, Ит в сыворотке крови 51
донора в возрасте от 20 до 46 лет. Сыворотка крови доноров была получена на
ОСПК (областная станция переливания крови) г. Пензы.
Полученные результаты биохимических анализов были подвергнуты
статистической обработке, согласно методам и приемам статистического
анализа.
По данным комитета экспертов Международной федерации клинической
химии по референтным величинам рекомендуется верхняя и нижняя границы нормы
на уровне М(1,96?, состояние предболезни М(2?, состояние острой формы М(3?.
Об уровне процессов ПОЛ судили по концентрации вторичного продукта
МДА. Содержание количества МДА составляет 3,61(0,07 мкМоль/л. Это значение
близко к данным, найденным в литературе (табл. 3.1.1). У 48 человек
значение содержания МДА входит в границы М(1,96?. У 3 человек (5 %)
содержание МДА соответствует значению М(2?, что соответствует состоянию
предболезни.
Активность каталазы у практически здоровых людей составила 16,7(0,15
мкат/л (табл. 3.1.1). При исследовании активности каталазы в группе доноров
отклонений за пределы М(1,96? мы не наблюдали.
Уровень холестерина, определяемый нами у практически здоровых людей
составил 4,45(0,68 ммоль/л (табл. 3.3.1.), показатели уложились в границу
референтной величины М(1,96?.
Содержание ЦИК, определяемое нами в сыворотке крови практически
здоровых людей составило 52,62(3,52 усл. ед. (табл. 3.1.1). 94 % людей по
показателям ЦИК входит в границы нормы, а 6% находятся в состоянии
предболезни.
Уровень МСМ у обследованных доноров в среднем составил 0,280(0,01
усл. ед. Это значение близко к данным, найденным в литературе (табл.
3.1.1). При исследовании МСМ отклонений за пределы М(1,96? мы не наблюдаем.
У практически здоровых людей определена детоксикационная нагрузка
сывороточного альбумина, т.е. определение общей и эффективной концентрации
альбумина. Токсичность по альбумину составляет 0,13(0,01 усл. ед. (табл.
3.1.1). Все значения токсичности по альбумину вошли в границы М(1,96?.
Полученные нами данные не имели существенных отличий от значений этих
показателей, имеющихся в литературе в сравнении с приложением 2.
Таблица 3.1.1.
Содержание биохимических показателей в сыворотке крови практически здоровых
людей
|Группа |n |МДА |Активност|ЦИК |МСМ |Ит |Холестер|
|обследованных | |мкМоль/л|ь |усл. ед. |усл. |усл. ед.|ин |
| | | |каталазы | |ед. | |ммоль/л |
| | | |мкат/л | | | | |
|Практически |51|3,61(0,0|16,7(0,15|52,62(3,5|0,28(0,|0,13(0,0|4,45(0,6|
|здоровые | |7 | |2 |01 |1 |8 |
2. Определение показателей уровня интоксикации
в сыворотке крови больных сальмонеллезом
Сыворотка крови больных исследовалась на базе центра
госсанэпиднадзора г. Пензы. Исследования биохимических показателей велись в
острую фазу заболевания и в период ранней реконвалесценции. Обследовано
нами 30 больных сальмонеллезом в возрасте от 17 до 46 лет, с целью
установления показателей, характеризующих эндотоксикоз: перекисное
окисление липидов, уровень холестерина, Ит по сывороточному альбумину,
циркулирующих иммунных комплексов, молекул средней массы и активности
каталазы. Причем биохимические показатели крови в разгар заболевания
отличались от показателей в период ранней реконвалесценции.
Таблица 3.2.1.
Биохимические показатели сыворотки крови
у больных сальмонеллезом
|Группа |МДА |Активност|Ит |ЦИК |МСМ |Холестери|
|обследованных |мкМоль/л |ь |усл. ед. |усл. ед. |усл. ед. |н ммоль/л|
| | |каталазы | | | | |
| | |мКат/л | | | | |
|Контроль, n=51 |3,61(0,07|16,7(0,15|0,13(0,01|52,62(3,5|0.280(0,0|4,45(0,68|
|(практически | | | |2 |1 | |
|здоровые) | | | | | | |
|Больные (острый|7,19(0,2 |13,09(0.1|0,29(0,01|100,63(4,|0,550(0,0|6,54(0,07|
|период) n=30 | |6 | |04 |2 | |
|Больные (ранняя|3,87(0,15|15,84(0,1|0,15(0,01|68,9(2,8 |0,310(0,0|4,65(0,7 |
| | |9 | | |2 | |
|реконвалесценци| | | | | | |
|я) n=30 | | | | | | |
| |р?0,001 |р?0,01 |р?0,001 |р?0,001 |р?0,05 |р?0,01 |
Так, в ходе исследования выявлено достоверное увеличение количества
МДА в сыворотке крови больных сальмонеллезом на 99 % по отношению к
контролю, т.е. возрастает в 2 раза. Данные наших исследований
подтверждаются сведениями Л.Б. Оконенко, Л.Д. Мартыненко и другими. По
данным этих авторов концентрация МДА при сальмонеллезе возрастает в 2-2,5
раза.
Как видно из таблицы (табл. 3.2.1), у больных наблюдается
интенсификация ПОЛ.
Под воздействием сальмонеллезного токсина происходит нарушение
Страницы: 1, 2, 3, 4, 5, 6
|
