Більшість клітинних ліній, резистентних до дії цисплатина відрізняються

підвищеним вмістом внутрішньоклітинного глутатіона та/чи гіпреактивністю

фермента, що ініціює синтез глутатіона g-глутамілцистеінсинтетази (g-ГЦС)

[38-40]. Однак описані приклади стійких до дії цисплатина клітинних ліній з

нормальним [41,42] та зниженим [43] у порівнянні з чутливими лініями вмістом

глутатіона.

Сучасні стереоскопічні та спректроскопічні методи дозволили визначити, що

глутатіон та цисплатин реагують безпосередньо у безклітинній системі в

молярному співвідношенні 2/1, утворюючи хелатний комплекс диглутатіонплатини.

Після 12 годин інкубації клітин в середовищі з цисплатином концентрація ГS-

Pt-кон`югатів стає максимальною. При цьому 60% внутрішньоклітинної платини

знаходиться у зв`язаному стані [10].

Заслуговують на увагу дані, отримані в експериментах з використанням

інгібітора синтезу глутатіона бутіонінсульфоксиміна (BSO). Обробка BSO

клітинних ліній раку шлунка людини MKN-28 та MKN-45 , раку яєчника КК та МН,

аденокарциноми ротової порожнини КВ призводить до сенсибілізації клітин до

дії цисплатина [44,45]. Причому витощення внутрішньоклітинного глутатіона за

допомогою BSO не впливало на акумулювання цисплатина в клітинах а також

формування кон`югатів GSH-Pt [46].

При вивчeнні взаємодії ферментів метаболізму глутатіона та їх ролі в

механізмах резистентності велике значення мають експерименти з використанням

культур клітин, трансфекованих генами відповідних ензимів. Наприклад, клітини

раку легенів людини, трансфековані геном фермента g-ГЦС, мають у 2 рази

більше глутатіона, в 1,6 рази підвищену активність ГS-Х-помпи та в 1,5 рази

меньшу акумуляцію цисплатина, в 6,7 рази більшу резистентність до цисплатина

у порівнянні з батьківською клітинною лінією. Витощення внутрішньоклітинного

глутатіона в трансфектах за допомогою BSO не впливало на резистентність до

цисплатина. У таких випадках зберіглась висока активність ГS-X-помпи і тому

внутрішньоклітинна концентрація платини не змінилася. Таким чином, в даній

клітинній системі резистентність обумовлена посиленим видаленням ГS-Pt-

конюгатів за допомогою ГS-Х-помпи, що не загубила своєї активності навіть при

витощенні субстрата (глутатіона) [47].

В той же час не винайдено ніякого зв`язку між рівнем експресії

глутатіонредуктази та глутатіонпероксидази та ступенем стійкості клітин до

дії цисплатина [48,49].

4.2.2.Металотеонеіни

Особлива роль у формуванні резистентності відводиться металотеонеінам.

Оскільки у вільному стані ці сполуки нуклеофільні, металотеонеіни зв`язуються

з електрофільними протипухлинними препаратами типу цисплатина, а також

мелфаланом та деякими антибіотиками: адріаміцином, блеоміцином та

доксорубіцином.

Клітини, що гіперексперсують металотеонеіни, часто резистентні до дії

цисплатина [50,51]. Однак металотеонеін не є обов`язковим компонентом

резистентності до цього препарату, оскільки зустрічаються резистентні до

цисплатина клітинні лінії, в яких металотеонеін не виявляється [43].

При обробці цисплатином резистентних до препарата клітин з підвищеним вмістом

металотеонеіна 70% внутрішньоклітинної платини знаходять у зв`язаному з

білком стані.

Досліди по трансфекції гена металотеонеіна ІІа показали, що клітини-

трансфекти набувають резистентності до цисплатина, хлорамбуцила та мелфалана

[52].

Добре виражена експресія металотеонеіна в пухлинах може мати прогностичне

значення. Наприклад, при лікування хворих на рак стравоходу за допомогою

цисплатина 5-річна життєздатність пацієнтів з металотеонеін-від`ємними

пухлинами становить 56%, а пацієнтів з металотеонеін-позитивними пухлинами –

26% [53].

З наведених вище даних можна заключити, що у випадках підвищеної експресії

металотеонеін є важливою складовою резистентності до цисплатина.

4.3.Репарація пошкоджень ДНК.

Резистентність клітин до дії цисплатина може залежати від стану системи

репарації пошкоджень ДНК.

Один з механізмів резистентності клітин до цисплатину – прискорена репарація

цисплатин-ДНК-адуктів [54]. Чутливі до дії цисплатина клітинні лінії

відрізняються зниженою здатністю ліквідувати основні адукти ДНК та цисплатина

(GG-Pt та GA-Pt), а також послабленою активністю ДНК-полімераз [55,56].

Обробка резистентних до цисплатина клітин афідикоіном – інгібітором ДНК-

полімераз a та b повертає чутливість до цисплатина, що стверджує роль

репарації адуктів цисплатин-ДНК у формуванні резистентності [57].

На сьогодні мало відомо, щодо ліквідації продуктів платинування ДНК у

мітохондріях. Вважають, що мітохондріальна ендонуклеаза G (Endo G) може брати

участь у репаративних процесах цих органел [58].

Нещодавно з культуральної рідини пухлинних клітин та біопсійного матеріалу

пухлин людини були виділені білки HMG (high-mobility group) та їм подібні,

які зв`язуються з ДНК, що пошкоджена цисплатином, але не трансплатином чи

ультрафіолетовим випроміненням [59,60]. Ці білки – висококонсервативні,

локалізуються у цитоплазмі та ядрі клітини. Їх біологічна роль ще точно не

встановлена. Інтенсивність зв`язування ДНК з цисплатином та HMG-подібними

білками прямо пропорційна ступеню пошкодження ДНК. ДНК резистентних клітин

зв`язується з цими білками більш ефективно. HMG-білки взаємодіють з

платинованою ДНК, закривають пошкоджені сайти від ферментів ексцизійної

репарації. Припускають, що зв`язування HMG-подібних білків з пошкодженою ДНК

може викликати зупинку реплікації чи транскрипції, а також впливати на роботу

систем контролю клітинного циклу при руйнуванні ДНК.

Відомо, що такі дефекти системи репарації невідповідностей (mismatch repair),

як недостатня експресія білків hMSH2 чи hMLH-1, призводять до виникнення

резистентності до цисплатина [61,62]. MSH2-білок сам по собі чи разом з

білком GTBP/p160 розпізнає невеликі зміни у ланцюгу ДНК, наприклад, продукти

платинування ДНК, і зв`язується з ними.

Априорі можна було б припустити, що відсутність якої-небудь частини системи

репарації ДНК сприяє розвитку гіперчутливості до дії цисплатина, що

відбувається у клітинах, дефектних за системою ексцизійної репарації. Але у

випадку порушення функції системи mismatch repair клітина набуває

резистентності до цисплатина. Цей феномен можна розглядати з двох позицій.

По-перше, порушення системи mismatch repair може бути наслідком індукованого

цисплатином випадкового мутагенезу, що в результаті обумовлює стійкість до

дії цисплатина. По-друге, саме дефект у роботі цієї системи репарації може

покласти початок резистентності [63,64].

Комплекс білків репарації “розпізнає” адукти у ланцюгу-шаблоні ДНК та

намагається виправити ланцюг, що синтезується [65]. Так, поки існує адукт у

ланцюгу-шаблоні, а підбір нових основ не ліквідує невідповідність, що існує,

генерується сигнал, який запускає програму апоптозу. Якщо система mismatch

repair не працює, такий сигнал не генерується, клітини стають толерантними до

адуктів цисплатин-ДНК та набувають резистентного фенотипу.

У випадку порушення системи ексцизійної репарації спостерігається протилежний

ефект. Клітини, дефектні по системі ексцизійної репарації значно більш

чутливі до дії цисплатина, ніж нормальні клітини [66].

Показано, що цисплатин індукує експресію важливого для ексцизійної репарації

гена ERCC-1. Але до активації гена ERCC-1 відбувається активації генів c-fos

та c-jun, а також фосфорилювання білка c-Jun [67].

Нещодавно був відкритий новий ген BRCA1, повязаний з репарацією пошкодженої

ДНК. Показано, що гіперекспресія цього гена в клітинах рака яєчника та

молочної залози асоційована з резистентністю до дії цисплатина [68].

Топоізомерази І та ІІ, що релаксують спіралі ДНК, є важливими ферментами

реплікації, транскрипції та рекомбінації. Вони відіграють суттєву роль у

процесах усунення адуктів ДНК-цисплатин. У багатьох резистентних до дії

цисплатина клітинах спостерігається підвищена активність топоізомерази ІІ

[69]. Інгібітори топоізомераз І та ІІ: етопозид, камтотецин, СРТ-11, SN-38,

новобіоцин – викликають сенсибілізацію резистентних клітин до дії цисплатина

[70-72].

Ще одним механізмом резистентності до цисплатина на рівні ДНК може бути

підвищена концентрація в клітині вільних нуклеотидів (наприклад, АТФ, АДФ),

які конкурують з ДНК за зв`язування з цисплатином [73]. Таким чином, вільні

нуклеотиди, концентрація яких у цитоплазмі відрізняється в різних клітинах,

можуть значно впливати на чутливість пухлин до цисплатина.

Важливо також розглянути утворення зшивок ДНК-білок під дією цисплатина. Хоча

кількість цих адуктів набагато менше, ніж у разі між- та внутри- ланцюгових

зшивок, але відмічено, що вони також відповідальні за цитотоксичний ефект

цисплатина. Наприклад, було показано, що одна резистентна до дії цисплатина

клітинна лінія раку яєчника утримувала у 6 разів менше цитокератина 18, ніж

чутлива лінія. Трансфекція кДНК цитокератина 18 в клітини резистентної лінії

давала клони з підвищеним рівнем цього білка та у більшості випадків з

чутливим фенотипом. При цьому було встановлено, що після обробки цисплатином,

з ДНК у клітинах зв`язуються негістонові білки. Пізніше ці білки було

ідентифіковано як цитокератини [74]. Можливо, що формування зшивок

цитокератин-ДНК, асоціюється з цитотоксичністю цисплатина. Тоді зменшення

продукції цитокератина 18 у резистентних клітинах веде до зменшення кількості

зшивок білок-ДНК та, як наслідок, зниження чутливості до цисплатина.

Виходячи з вищенаведеного, можна заключити, що резистентність до дії

цисплатина на рівні ДНК обумовлена підвищеною активністю систем репарації

клітини чи її толерантністю до існуючих ДНК-Pt-адуктів.

4.4.Зміни генома, що асоційовані з резистентністю до цисплатина.

Оскільки клітинна резистентність є стійко спадковою ознакою в ряду поколінь,

можна зробити висновок, що стійкість до дії цисплатина визначається

генетичними особливостями клітини.

Встановлено, що основна роль в цьому феномені належить 11-й та 16-й

хромосомам у людини [75]. На клітинних гібридах з різним хромосомним складом

було показано, що обовязковою умовою резистентного фенотипа є наявність 16-ї

хромосоми з резистентних клітин та 11-ї хромосоми з чутливих клітин. При

цьому основну роль грає 16-та хромосома, а 11-та хромосома необхідна для її

нормального функціонування. Ці хромосоми залучені у різні боки

резистентності. На 16-тій хромосомі присутні гени MRP (multidrug resistance

associated protein), LRP (lung resistance protein), гени додаткового білка

ексцизійної репарації-4, металотеонеіна. На 11-їй хромосомі розташовані гени,

що кодують глутатіон трансферазу p (ГSТ-p), а також протеін, що розпізнає

специфічні послідовності пошкодженої ДНК.

Чутливість пухлинних клітин до дії цисплатина може залежати від

функціональної активності генів р 53 та генів родини bcl.

На сьогодні все ще залишається відкритим питання про зв`язок лікарської

резистентності з р 53-статусом клітин. Невизначеність тут існує тому,

що роль білка Р 53 у хемочутливості клітин до лікарської терапії розглядають з

двох протилежних точок зору: 1) експресія білка Р 53 дикого типу (wt p 53

) збільшує чутливість до хіміотерапії шляхом прискорення входження клітин в

апоптоз; 2) білок wt P 53 зменшує хемочутливість, оскільки після пошкодження

ДНК обумовлює зупинку росту для репарації ДНК [76].

Відомо, що після дії цисплатина у чутливих клітинах збільшується рівень

експресії гена р 53 та відповідно – білка Р 53. Р 53 індукує експресію

білка р 21/WAF1/CIP1-інгібітора циклін залежних кіназ, що грає важливу роль у

зупинці клітинного циклу у G1-фазі після генотоксичного стресу

[77,78]. Під час цієї зупинки клітиною приймається “рішення”: репарувати ДНК чи

входити в апоптоз, в залежності від глибини пошкодження. На сьогодні ще

невідомі усі біохімічні подробиці того, як активація р 53 ініціює

апоптоз.

Більшість робіт по вивченню функціональної активності Р 53 у резистентних до дії

цисплатина клітинах засвідчують, що мутації гена р 53 призводять до розвитку

резистентності до хіміотерапії [79-82]. Показано, що в резистентних клітинах

часто порушена внутрішньоклітинна локалізація білка Р 53 [83] а також не

відбувається індукція експресії Р 53 та р 21 цисплатином [84,85]. Досліди по

трансфекції гена р 53 також довели, що перенос у дефектні за функцією Р

53 чи null-клітини wt p53-гена обумовлює збільшення чутливості до

лікарських препаратів, а трансфекція мутантного гена mut p 53 спричиняє

розвиток резистентності [86].

Досліджено, що в клітині після дії цисплатина разом з р 53 індукується

експресія гена mdm 2. Продукт даного гена відрізняється властивістю

утворювати комплекси з білком Р 53 , таким чином дезактивуючи частину

Страницы: 1, 2, 3, 4