К 1000 мл мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.

Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50 -55°С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 мл мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивают крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч, чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем рН 7,0 - 7,4, разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120°С.

Приготовление среды Левина

К 100 мл расплавленного мясо-пептонного агара с рН 7,0 - 7,4 добавляют 2 мл 0,5%-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 мл 2%-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0,2 г двузамещенного фосфорного калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100°С. После добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают, разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.

Приготовление среды Китт - Тароцци

Свежую печень крупного рогатого скота разрезают на куски массой по 50 - 60 г, заливают равным количеством воды и кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании. Печеночный экстракт фильтруют через ватно-марлевый фильтр и смешивают с мясо-пептонным бульоном из расчета одна часть печеночного экстракта на три части бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют хлористый натрий из расчета 1,25 г на 1000 мл среды и устанавливают рН 7,6 - 7,8, после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный фильтр.

В пробирки кладут мелко нарезанные кусочки печени по 1,5 - 2 г и заливают смесью печеночного экстракта с мясо-пептонным бульоном. На поверхность среды наслаивают 0,5 - 1 мл вазелинового масла. Среду стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120°С.

Приготовление бульона Хоттингера и среды, его содержащей.

Для приготовления основного раствора Хоттингера в 1 дмЗ кипящей воды на 20 мин опускают 1 кг мяса, нарезанного маленькими кусочками, затем мясо вынимают, измельчают на мясорубке и снова кладут в тот же отвар. Добавляют 30-40 г измельченной поджелудочной железы (или 3-5 г панкреатина) и 20 смЗ хлороформа. Бутылки плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают, ставят в термостат при температуре 37°С на 3-4 часа. Мясо в виде мелкозернистой массы осаждается на дно бутылки. Жидкость над мясом должна быть прозрачной. Жидкость сливают, фильтруют и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин. Готовый раствор должен давать положительную реакцию на триптофан (розовое окрашивание при прибавлении 2 капель бромной воды в пробирку с пробой).

Для приготовления бульона Хоттингера смешивают 200 смЗ основного раствора Хоттингера, 400 смЗ мясного отвара и 400 смЗ, добавляют 5 г хлористого натрия, 0,2 г фосфорнокислого двузамещенного натрия, кипятят 10 мин и устанавливают рН (7,6±0,1). Бульон Хоттингера разливают высоким столбиком по пробиркам или флаконам, на дно которых кладут кусочки вареного мяса или фарша, наслаивают стерильное вазелиновое масло высотой около 2,0 см и стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 20 мин.

Для приготовления плотной среды Хоттингера с триптоном, глюкозой и дрожжевым экстрактом в 1 дмЗ бульона Хоттингера вносят 0,5 г дрожжевого экстракта или 2,5 смЗ раствора дрожжевого экстракта, 5 г глюкозы, 5 г триптона, 15-20 г агара, устанавливают рН среды (7,1+0,1) и стерилизуют ее при температуре (121±1)°С в течение 20 мин. Перед употреблением в расплавленную стерильную среду асептически вносят 0,6 г аскорбиновой кислоты.

Приготовление среды Крумведе-Олькеницкого в модификации Ко-валъчука

В 1 дм3 дистиллированной воды растворяют I г гипосульфита, 0,6 г соли Мора, 10 г мочевины, 15 г лактозы х.ч., 3,5 г сахарозы и 2 г глюкозы. Устанавливают рН среды до 7,4 - 7,6. Добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором ВР. Все размешивают, кипятят в водяной бане в течение 40 мин. Разливают в пробирки по 5 - 6 см3. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 5104 Па. После стерилизации среду скашивают так, чтобы в пробирке остался столбик высотой не менее 3 см.

Приготовление среды ХБ (хинозол-бромкрезол-пурпурной)

Для приготовления бромкрезол-пурпура 0,8 г порошка заливают 50 см3 этилового ректификованного спирта. Через день раствор готов к употреблению.

Для приготовления хинозола 0,1 г порошка растворяют в 100 см3 стерильной дистиллированной воды.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

Глубинный метод посева в плотные среды.

Жидкий продукт или разведение навески вносят параллельно в две чашки Петри и заливают не позднее чем через 15 мин расплавленной и охлажденной до температуры (45±1)°С питательной средой. Высота слоя питательной среды должна быть 4--5 мм.

Среду немедленно равномерно перемешивают с посевным материалом круговыми движениями чашки так, чтобы среда не вытекла из чашки н не загрязняла крышку. После застывания среды чашки с посевами вверх дном помещают в термостат.

Поверхностный метод посева на плотные среды.

Среду налипают в чашку Петри и после застывания подсушивают. При подсушивании для удаления влаги с поверхности среды чашки открывают, переворачивают вверх дном и выдерживают в течение 30 мин при 48--50°С или в ламинарном боксе 1--2 ч. или в других условиях, обеспечивающих испарение конденсационной влаги и исключающих микробное загрязнение.

На подсушенную среду наносят жидкий продукт или разведение навески и немедленно равномерно растирают по поверхности шпателем -- изогнутой стеклянной палочкой.

Засеянную поверхность подсушивают, выдерживая чашки в горизонтальном положении в течение 15 мин.

Метод посева в жидкие среды.

В колбу или пробирки с питательной средой вносят навеску продукта или разведеные навески.

При определении наиболее вероятного числа (НВЧ) микроорганизмов из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений до такой степени, чтобы можно было определить предполагаемое НВЧ микроорганизмов.

Самое низкое разведение и высеваемые объемы его инокулума выбирают в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов н чувствительности метода следующим образом:

По 1 смЗ из разведения 10-1 и высших разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 1,0 г продукта;

по 10 смЗ из разведения 10-1 или 1 смЗ неразведенного продукта и по 1 смЗ из разведения 10-1 и более высокого разведения, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 10,0 г продукта;

по 10 и 1 смЗ неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превыщающее 3 клетки в 100 смЗ продукта.

Все разведения и неразведенный продукт высевают параллельно в три пробирки с питательной средой. Инокулум объемом 1 смЗ высевают в 10 смЗ среды нормальной концентрации, инокулумы объемом 10 смЗ в 10 смЗ среды двойной концентрации.

Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов.

В стерильную колбу помещают 50 г корма, взятого из среднего образца (взятие корма для навески одноразовое), добавляют 450 мл физиологического раствора (получают разведение 1:10), тщательно встряхивают. Из полученной взвеси готовят последовательные десятикратные разведения (1:100, 1:1000, 1:10000 и т.д.). После оседания взвешенных частиц из верхнего слоя жидкости делают посевы

Для количественного учета микробного обсеменения в стерильные бактериологические чашки вносят по 1 мл каждого разведения и заливают 10-15 мл стерильного, расплавленного и охлажденного до температуры 44-45°С мясопептонного агара. Осторожно покачивая чашки, засеянный материал равномерно распределяют в агаре. После застывания среды чашки помещают (вверх дном) в термостат при температуре 30°С. После 72 часового, термостатирования проводят, подсчет выросших колоний только в чашках, где содержатся не более 300 и не менее 3 колоний. Результаты, полученные при подсчете колоний, умножают на разведения, вычисляют среднее арифметическое. Полученная цифра принимается за общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов в 1 г корма.

Исследования на сальмонеллы.

Метод последовательного обогащения.

Навеску исследуемого материала 25г помещают в колбу, содержащую 225 мл забуференной пептонной воды (среда предварительного обогащения).

Содержимое колбы тщательно перемешивают и помещают в термостат при температуре 37°. Через 6-18 часов производят пересев на основные среды обогащения (селенитовый бульон, магниевую среду или другую аналогичную среду по выбору) в соотношении 1:5.

После 16 - 18 час. инкубирования в термостате при 37° из обогатительных сред бактериологической петлей производят посевы на бактериологические чашки с твердыми дифференциально-диагностическими средами (висмут-сульфитный агар, среда Эндо или другие аналогичные среды по выбору), которые помещают в термостат при 37°.

Засеянные чашки просматривают через 24 - 48 часов.

На висмут-сульфит агаре S. typhi, S paratyphi А растут в виде мелких, нежных, серовато-зеленых колоний с черным центром; S. cholerae suis - в виде зеленых колоний. Колонии почти всех других сальмонелл значительно крупнее, темно-коричневого цвета с ртутным блеском, окруженные светлым ореолом, участок среды под колонией прокрашен в темно-коричневый цвет.

В случае обнаружения колоний, подозрительных на сальмонеллы, 3-5 из них засевают на МПА (для постановки РА), на бульон Хоттингера (для определения индола и сероводорода), в полужидкий (0,3 - 0,5%) агар (посев уколом для определения подвижности) и трехсахарный агар с мочевиной Крумвиде - Олькеницкого (сначала штрихом на скошенной поверхности, а затем уколом и глубину столбика). Посевы выдерживают в термостате при температуре 37° 16-18 часов. При росте бактерий из рода Salmonella цвет скошенной поверхности среды Крумвиде - Олькеницкого -розовый, столбик - желто-бурый, газообразование устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара, при наличии сероводорода столбик чернеет.

При разложении лактозы косая поверхность окрашивается в желтый цвет. При разложении одной глюкозы окрашивается только столбик среды и происходит разрыв агара со скоплением в нем пузырьков газа. При разложении мочевины на "скошенном столбике" окраска среды меняется на малиновую.

Культуры, представляющие грамотрицательные, подвижные палочки, ферментирующие глюкозу с образованием газа, не ферментирующие лактозу и сахарозу, не разлагающие мочевину и не образующие индол, подвергаются серологическому исследованию в реакции агглютинации на предметном стекле с набором агглютинирующих сывороток в соответствии с Наставлением к набору. Для реакции агглютинации используют суточные культуры, выращенные на МПА. При этом для реакции агглютинации с О - сыворотками культуру следует брать из верхней части скошенного агара, а для агглютинации с Н - сыворотками - из самой нижней части (конденсационной воды), где микробы наиболее подвижны.

Определение присутствия бактерий группы кишечной палочки

Метод основан на способности бактерий группы кишечной палочки расщеплять маннит, образовывать на средах "ХБ" и Хейфеца кислые продукты, изменяющие цвет индикаторов, входящих в состав этих сред.

По 1 смЗ каждого разведения вносят (по выбору) в пробирки, содержащие по 5 смЗ среды: Эйкмана, Кесслер, Булира, Хейфеца, "ХБ" или КОДА. Посевы помещают в термостат при температуре 43°С для первых пяти сред и 37°С для последней.

Через 24 ч учитывают рост на среде Эйкмана, Булира по помутнению среды и образованию газа, на средах Кесслер, Хей а также на бульон Хоттингера для определения индола и сероводорода). Для определения подвижности культуры производят посев уколом в полужидкий агар (0,3 -0,5%). Титр кишечной палочки устанавливают по наибольшему разведению, в. котором еще наблюдался рост.

Из пробирок, где наблюдается рост микробов, производят посев в количестве 0,1-0,2 смЗ на плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Левина) и выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч.

Типичные колонии Е. coli характеризуются круглой формой, выпуклой или слегка приподнятой в центре поверхностью, ровными краями, розового, красного или малинового цвета с металлическим блеском или без него на среде Эндо и фиолетового или черного - на среде Левина.

Выросшие изолированные колонии (не менее 4) пересевают на мясо - пептонный бульон, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение 18-24 ч. После этого одну часть пробирок используют для приготовления мазков, посева на дифференциально-диагностические среды, заражения мышей, вторую - для приготовления кипяченого антигена.

У выделенных культур изучают морфологические, культурально-биохимические и патогенные свойства с целью проведения их родовой дифференциации. Культурально-биохимические свойства изучают по комплексу ЛИМАЦ (лактоза-)-индол+метил-рот+реакцня фогес Проскауе-ра - усвоение цитатно-аммонийных солей.

Одновременно с определением морфологических, культурально-биохимических и патогенных свойств бактерий проводят серологическую типизацию культур кишечной палочки по О-антигену.

Для приготовления антигена каждую предназначенную для типизации суточную агаровую культуру (пробирку со скошенным агаром) смывают стерильным физиологическим раствором, доводят суспензию бактерий до концентрации 5-6 млрд/смЗ, кипятят в водяной бане в течение 1 ч и ставят реакцию агглютинации на стекле с комплексной 0-сывороткой, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:5.

Если комплексные О-колисыворотки в начальной реакции не агглютинируют антиген из убитой нагреванием культуры, то готовят из этого штамма суспензию бактерий и автоклавируют ее при давлении 105 Па (1 ат.ч) в течение 2 ч для разрушения термостабильного А антигена. Авто-клавированный антиген исследуют с сыворотками 08,09, 0101.

Страницы: 1, 2, 3