2.3. Пробу воды (до 500 мл) центрифугируют при 10-15 тыс. об/мин в течение 30 - минут, сливают надосадочную жидкость, а осадки из всех центрифужных стаканов суспензируют в стерильной - питательной среде для лептоспир или физиологическом растворе. Суспензию вводят внутрибрюшинно или подкожно хомякам по 0,5-1 мл, крольчатам и морским свинкам по 1-2 мл. В дальнейшем исследуют, как указано в п. 2.2.

2.4. Полученный после центрифугирования осадок подкожно вводят в дозе 2-3 мл взрослым кроликам, не имеющим в крови лептоспирозных антител,

Через 7-14 и 20 дней кровь кролика исследуют по РМА с лептоспирами 13 серологических групп. Обнаружение специфических антител в титре 1: 10 и выше свидетельствует о наличии лептоспир в исследуемой пробе воды.

3. Импрегнация гистологических срезов из органов серебром по левадити

3.1. Материалом для гистологического исследования служат кусочки коркового слоя почек и печени толщиной не более 1 см, консервированные 10%-ным раствором формалина.

Лептоспиры удается обнаружить с наибольшим постоянством в гистологических срезах импрегнированных серебром по Левадити. Методы Крантца, Полагута и Майера менее эффективны.

3.2 Несколько кусочков органов не толще 1 см, лучше 2-'3 мм, фиксируют в 10%-ном водном растворе нейтрального формалина 24-48 часов. После фиксации кусочки переносят в 96° спирт на 24 часа. Промывают в дистиллированной воде до тех пор, пока кусочки не осядут на дно бюкса (не менее 2-3 часов), воду меняют три раза.

3.3. Помещают кусочки в 1-3%-ный раствор азотнокислого серебра на 3-6 дней. Процесс серебрения ведут при температуре 37 °С. Раствор азотнокислого серебра готовят на свежей дистиллированной воде из расчета 15 мл раствора на один кусочек.

3.4. Прополаскивают в дистиллированной воде в течение 2-5 минут. После промывки кусочки переносят в небольшую порцию редуцирующей смеси в отдельной чашечке на 2 минуты (раствор быстро темнеет) и затем помещают их в приготовленный перед употреблением основной редуцирующий раствор следующего состава: пирогалловая кислота - 4 г, дистиллированная вода - 100 мл, формалин чистый - 5 мл.

Раствор готовят из расчета 20-25 мл на один кусочек ткани. Восстановление обязательно проводят в банке из темного стекла.

3.5. Кусочки выдерживают в редуцирующей смеси 24-48 часов при комнатной температуре в темном месте или в банке из темного стекла.

Время выдержки контролируют приготовлением единичных срезов через каждые 12-16 часов во избежание передержания, так как срезы могут стать черными. Промывают в дистиллированной воде 1-2 часа.

3.6. Обрабатывают препараты последовательно спиртами: в 96° спирт (спирт 1) на сутки; в 96° спирт (спирт 2) на сутки; в 96° спирт (спирт 3) - на сутки; спирт-метил (спирты этиловый и метилсалициловый поровну) - до опускания кусочков на дно бюкса, а затем в метилсалициловый - до утра.

3.7. После этого перекладывают в кашу-парафин (ксилол и парафин поровну) на 30 минут при 57°; парафин 1 - на 60 минут при 57 °С; парафин 2 - на 60 минут при 57 °С.

Из быстро остуженного парафина вырезают блок с кусочком органа и наклеивают на деревянный кубик. Приготавливают тонкие срезы на санном микротоме и наклеивают на предметное стекло, депарафинируют в трех бюксах с ксилолом по 10-15 минут в каждом и заключают под покровное стекло в канадский бальзам, подсушивают и просматривают под микроскопом со светлопольным конденсором при увеличении 90X7-10.

В случае неудовлетворительных результатов импрегнации лептоспир готовят препараты из других одновременно приготовленных блоков. Препараты необходимо хранить в темноте.

3.8. Микрокартина: лептоспиры черные, окружающая ткань буровато-желтая. Лептоспиры располагаются на поверхности эпителия и в просветах мочевых канальцев почек, несколько реже - в цитоплазме эпителия, преимущественно группами. После импрегнации серебром типичные лептоспиры имеют S-образную с 1-2 изгибами или змеевидную форму с грубыми, толстыми завитками, которые в отдельных случаях слабо заметны. Иногда в просвете и на поверхности эпителия мочевых канальцев встречаются аргирофильные гранулы (окрашены в цвет лептоспир), 'которые при отсутствии типичных форм нельзя принимать за лептоспир.

4. Серологическая диагностика лептоспироза

4.1. Серологическая диагностика лептоспироза основана на обнаружении специфических антител в крови животных, реакцией микроагглютинации (РМА) или реакцией микроагглютинации (РА).

4.2. Сыворотку крови животных исследуют на лепто-спироз по РМА или РА для выяснения благополучия хозяйства по этому заболеванию и установления диагноза на лептоспироз у отдельных животных.

В последнем случае проводят 2-3-кратное исследование. Кровь берут для исследования на 5-7-й день болезни и повторно через 7-10 дней.

4.1. Порядок постановки и учета реакции микроагглютинации (РМА)

4.1.1. Для постановки реакции микроагглютинации необходимы:

- исследуемая сыворотка крови животных;

- антигены - культуры диагностических штаммов лептоспир;

- электролит - физиологический раствор;

- микроскоп, конденсор темного поля и осветитель те же, что для микроскопической диагностики;

- агглютинационные пластинки или пробирки Флоринского;

- 40-100-гнездные штативы;

- бактериологические пробирки;

- градуированные пипетки на 1, 2, 5 и 10 мл;

- аппарат Флоринокого;

- предметные стекла.

4.1.2. Исследуемая сыворотка. Для исследования пригодна сыворотка свежая, замороженная, высушенная на фильтровальной бумаге, консервированная фенолом или борной кислотой. Консервируют отстоявшуюся сыворотку, слитую в сухие стерильные пробирки.

Добавляют 5%-ный раствор фенола при постоянном помешивании 0,05 мл (1 капля) на каждый миллилитр сыворотки.

Борную кислоту вносят в сыворотку до получения насыщенного раствора и образования на дне пробирки небольшого осадка кристаллов. Кристаллы кислоты не должны попадать в пипетку во время постановки реакции.

Высушивают сыворотку на квадратах (5X5 см)' белой фильтровальной бумаги по 3-5 капель (0,05 мл каждая) при комнатной температуре или в термостате при температуре 37 °С. Консервированные пробы сыворотки пригодны для исследования в течение месяца. Гемолизированные, загнившие, плесневелые и проросшие сыворотки не исследуют.

4.1.3. Антигены. В качестве антигенов в РМА используют живые культуры лептоспир различных серологических групп. Республиканские лаборатории ставят реакцию с лептоспирами 13 серологических групп: Icterohaemorrhagiae, Javanica, Canicola, Pyrogenes, Cynoptery, Autumnalis, Pomona, Grippotyphosa, Hebdomadis, Tarassovi, Bataviae, Australis, Ballum.

Краевые, областные, межрайонные лаборатории исследуют сыворотку домашних животных с антигенами 6 серогрупп: Grippotyphosa, Pomona, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi, Hebdomadis, Canicola.

Сыворотку крови диких животных исследуют с лептоспирами 13-15 серогрупп.

В РМА используют эталонные штаммы лептоспир или их аналоги, рекомендованные Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов МСХ СССР.

Диагностические штаммы лептоспир лаборатории получают во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов МСХ СССР, и поддерживают их периодическими пересевами через каждые 10 -15 дней.

Пригодность культуры для использования в реакции оценивают путем просмотра пробирок в проходящем свете и микроскопией.

При достаточном накоплении лептоспир после встряхивания пробирки с культурой в проходящем свете в среде хорошо заметны муаровые волны, а в спокойном состоянии легкая опалесценция. Наличие осадка, пленки, помутнения среды свидетельствует о прорастании культуры посторонней микрофлорой, полная прозрачность среды - об отсутствии лептоспир.

В реакции используют чистые культуры лептоспир в возрасте 5-15 дней без признаков агглютинации и лизиса (четкообразные, неподвижные клетки) с накоплением 70-100 микробных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении 20X10X1,5 или 40X7-10. Культуры, содержащие 150-200 и более лептоспир в поле зрения микроскопа, разводят перед постановкой реакции питательной средой или физиологическим раствором до указанной концентрации.

Каждое разведение сыворотки разливают в отдельный ряд, состоящий из 5-13 лунок (пробирок) в зависимости от количества антигенов, используемых в реакции. Каждую культуру-антиген вносят по 0,1 мл в три лунки с разными разведениями сыворотки. После добавления антигенов пластины встряхивают и выдерживают в термостате при температуре 30 °С в течение часа.

Контролем служит смесь культуры лептоспир с физиологическим раствором по 0,1 мл. Лептоспиры в контроле должны оставаться подвижными, не иметь признаков лизиса и агглютинации.

4.1.8. Реакцию учитывают путем микроскопии капель из каждой лунки в темном поле микроскопа при увеличении 20X10 или 20X7X1,5. Капли из лунок выносят на предметное стекло бактериологической петлей от большего разведения к меньшему и просматривают их без покровного стекла. Капли можно наносить двумя способами: 1) бактериологической петлей диаметром 3 мм наносят на стекло сразу до 30 капель и затем просматривают их под микроскопом; 2) бактериологической петлей диаметром 1 мм наносят на предметное стекло в освещенный центр поля зрения одну каплю и просматривают ее, передвигают столик на 2-3 мм и рядом с первой наносят и учитывают вторую каплю. В этом случае на одном предметном стекле учитывают 60-80 капель.

После каждого антигена петлю прокаливают и охлаждают.

4.1.9. Результаты реакции оценивают в крестах по четырехбалльной системе:

+ + + +агглютинированы 100% лептоспир;

+ + + - агглютинированы 75% лептоспир;

+ + - - агглютинированы 50% лептоспир;

+ - - - агглютинированы 25% лептоспир;

- (знак минус) агглютинация отсутствует. Агглютинация проявляется в склеивании лептоспир и образовании паучков. Паучок включает от 3-5 до нескольких десятков и даже сотен лептоспир. Свободные концы лептоспир сохраняют подвижность.

В начальных разведениях сыворотки может наблюдаться лизис лептоопир, проявляющийся в набухании и обездвиживании, появлении зернистости и полного распада микробных клеток.

4.1.10. Положительной считают реакцию, оцененную не менее чем на два креста, при отсутствии агглютинации в 'контроле.

При повторном исследовании сыворотки крови реакцию ставят в тех же разведениях.

4.2. Порядок постановки и учета реакции макроагглютинации (РА)

Реакцию макроагглютинации ставят и учитывают в соответствии с Временным наставлением по применению антигенов для диагностики лептоспироза у животных реакцией макроагглютинации, утвержденным Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 12 мая 1974 года.

4.3. Оценка показаний РМА и РА

4.3.1. Животных с титром сыворотки в РМА 1: 100 или реагирующих по РА на 1-2 креста, кроме лошадей и крупного рогатого скота, реагирующих с лептоспирами группы Hebdomadis, считают подозреваемыми в заражении.

Крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis, и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серологической группы, считают подозреваемыми в заражении при титре антител в РМА 1: 500 или реагирующих в РА на 1-2 креста с неразведенной сывороткой.

Кровь от животных, подозреваемых в заражении, и от животных, не реагировавших при первом исследовании, повторно проверяют через 7-10 дней.

4.3.2. Выявление антител у животных, не реагировавших при первом исследовании, или нарастание титра у реагировавших в РМА в пять и более раз, или положительная РА на 3-4 креста свидетельствуют об активном инфекционном процессе у обследуемых животных.

4.3.3. Животных (кроме лошадей и реагирующего с лептоспирами группы Hebdomadis крупного рогатого скота) с титром сыворотки в РМА 1: 500 и более или в РА на 3-4 креста и крупный рогатый скот, реагирующий с лептоспирами группы Hebdomadis и лошадей, реагирующих с лептоспирами любой серогруппы при титре в РМА 1:2500 и более или в РА на 3-4 креста, рассматривают как возможных лептоспироносителей.

4.3.4. Возбудителями лептоспироза при серологической диагностике считают лептоспир той серологической группы, к которой обнаружены антитела в наиболее высоком титре.

Необходимо учитывать, что в сыворотке крови свиней, крупного рогатого и мелкого рогатого скота и лошадей при исследовании по РМА обнаруживают в 5 - 15% случаев (из числа положительно реагирующих) антитела в наиболее высоком титре к лептоспирам Australis, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Bataviae, которые не были выделены ни в одном случае от сельскохозяйственных животных.

Такие реакции следует рассматривать как межгрупповые, являющиеся следствием заражения животных лептоспирами Pomona, Tarassovi и другими, обычно выделяемыми от сельскохозяйственных животных.

Лептоспиры Australis, Bataviae, Autumnalis, Ballum, Pyrogenes, Cynoptery, Kazachstanica могут быть признаны возбудителями лептоспироза у сельскохозяйственных животных только после выделения этих лептоспир в чистой культуре или подтверждении их роли реакцией иммуноабсорбции.

4.4. Методика постановки реакции иммуноабсорбции при исследовании проб сыворотки

4.4.1. В реакции иммуноабсорбции изучают пробы сыворотки животных, агглютинирующие лептоспиры нескольких серологических групп в равно высоких титрах или имеющие наиболее высокий титр - по отношению к лептоспирам, ранее не известным в качестве возбудителя лептоспироза у сельскохозяйственных животных.

4.4.2. Для проведения абсорбции выращивают в 0,2 - 0,5 - литровых флаконах все штаммы лептоспир, с которыми данная проба сыворотки дала реакцию агглютинации. К 5-7-суточным культурам добавляют 0,3% формалина и выдерживают 10-12 часов. Затем лептоспиры осаждают центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 30 минут. Сливают надосадочную жидкость, а осадок суспензируют в объеме 0,9 мл среды или физиологического раствора, 0,1 мл исследуемой сыворотки смешивают с 0,9 мл концентрированного антигена и выдерживают в течение 48 часов при температуре 1-5 °С. Абсорбированную сыворотку проверяют в РМА на наличие остаточных антител к штамму-абсорбенту, а затем исследуют с лептоспирами групп, с которыми реагировала сыворотка до абсорбции.

4.4.3. В процессе абсорбции лептоспиры, являющиеся возбудителем инфекции у данной особи, извлекают из сыворотки антитела к лептоспирам всех других серологических групп, в то время как антитела к штамму-возбудителю болезни не абсорбируются из сыворотки гетерологичными типами лептоспир.

Для сокращения объема работы сыворотку можно в начале абсорбировать лептоспирами, являющимися наиболее частыми возбудителями болезни у животных данного вида.

4.4.4. Оценка эпизоотической ситуации в хозяйстве по результатам лабораторных исследований приведена в Инструкции о мероприятиях по борьбе с лептоспирозом животных пп. 2.4., 2.5. и 2.6.

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5