Холера

Владивостокский Государственный Медицинский Университет

Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии

Р е ф е р а т

Холера

Выполнил: Новак А.Л.

301 гр. л/ф

Владивосток, 1998.

Этиология

Возбудитель холеры относится к роду Vibrio. Это изогнутая,

грамотрицательная, не образующая споры палочка, имеющая один полярно

расположенный жгутик. По чувствительности к специфическому фагу (IV тип по

Мукерджи) различают два биотипа холерного вибриона — классический

(возбудитель азиатской холеры) и Эль-Тор. Каждый из них по 0-антигену

подразделяется на 3 серологических типа: Огава (АВ), Инаба (АС) и редко

встречающийся Гикошима (АВС), который некоторые авторы рассматривают как

вариант серотипа Огава. Н-антиген холерных вибрионов — общий для всех

серотипов.

Холерные вибрионы образуют термолабильный экзотоксин — холероген

(относительная молекулярная масса — 82—84 кд). Он состоит из комплекса

тяжелой субъединицы А, активирующей аденилатциклазу, и субъединицы В,

представленной 4—6 легкими цепями и обеспечивающей связывание холеро-гена с

рецепторами эпителиальных клеток тонкой кишки.

Биолого-патогенетические свойства возбудителя

Миновав желудочный барьер, вибрионы попадают в тонкую кишку с

благоприятной для них средой и заселяют (колонизируют) поверхность

кишечного эпителия. Процесс колонизации включает в себя хемотаксис

вибрионов к слою слизи, покрывающему верхушки ворсинок тонкой кишки,

проникновение через эту слизь, адгезию к рецепторам на исчерченной каемке

кишечных эпителиоцитов и размножение на поверхности эпителия ворсинок и

крипт. У больных холерой возбудитель может быть обнаружен на всем

протяжении желудочно-кишечного тракта. В желудке при рН не менее 5,5

вибрионы не обнаруживаются, в стуле их концентрация достигает 106—107

(иногда ^—Ю9).

Размножившись до определенной концентрации, возбудитель вызывает

заболевание посредством вырабатываемого им холерогена. Основную роль в

развитии болезни играют вибрионы, которые находятся в тесной связи со

слизистой оболочкой тонкой кишки, так как они выделяют холероген в

непосредственной близости от его рецепторов на эпителиальных клетках — ган-

глиозида GM1. После прикрепления холерного токсина к ганглиозиду

субъединица А проходит через мембраны внутрь эпителиальной клетки, где

происходит высвобождение фрагмента А1. Последний энзиматически расщепляет

НАД и передает его АДФ-рибозную половину на регуляторный протеин

аденилатциклазного комплекса, находящегося на внутренней стороне мембраны

эпителиоцита. В результате происходит активация аденилатциклазы, приводящая

к повышению содержания цАМФ — одного из внутриклеточных стимуляторов

кишечной секреции. Связывание холерного токсина с рецепторами на

эпителиальных клетках происходит чрезвычайно быстро (через 1—3 мин);

биохимические нзменения в клетке являются необратимыми.

Возникающее заболевание сопровождается потерей огромных количеств

жидкости с низким содержанием белка и высокой концентрацией ионов натрия,

калия, хлоридов, гидрокарбонатов. Эта жидкость по составу отличается как от

экссудата, так и от транссудата и ближе к составу кишечного секрета.

Восприимчивость

К холерному вибриону восприимчивы люди всех возрастов. Чаще и тяжелее

болеют холерой лица, злоупотребляющие алкоголем или перенесшие резекцию

желудка. Кислотность желудочного сока играет важную роль в определении

минимальной инфицирующей дозы — в опытах на добровольцах при нейтрализации

желудочного сока гидрокарбонатом натрия количество вибрионов, необходимых

для воспроизведения специфического процесса у человека, уменьшается с 10"

до 104—10Ь микробных клеток.

Клинические особенности

Инкубационный период при холере длится от 1 до 5 дней. Клинические

проявления холеры весьма варьируют, и тяжесть клинического течения

определяется степенью обезвоживания. Заболевание начинается обычно

внезапно. Первым клинически выраженным признаком холеры является понос.

Типичные холерные испражнения представляют собой водянистую, мутновато-

беловатую жидкость с плавающими хлопьями, напоминают по внешнему виду

рисовый отвар и не имеют запаха. Мышечная слабость и судороги в икроножных

мышцах — ранние симптомы холеры. Вслед за жидким стулом появляется обильная

повторная рвота, быстро приводящая к декомпенсированному эксикозу. Кожные

покровы становятся цианотичными, холодными на ощупь, черты лица

заостряются, глаза и щеки западают. Кожа кистей рук морщинистая («руки

прачки»), голос сиплый, вплоть до афонии. У больных с тяжелой формой холеры

отмечается гипо-термия. Из-за ее постоянства терминальная форма холеры (IV

степень дегидратации) получила название «алгидная». Алгид

(декомпенсированное обезвоживание) сопровождается нарушением деятельности

основных систем организма — сердечно-сосудистой, дыхательной,

мочевыделительной.

Иммунологическая диагностика

Обнаружение антигена. Возбудитель холеры и его специфические антигены

(корпускулярный, растворимый, холероген) выявляют в фекалиях, рвотных

массах, крови, дуоденальном и кишечном содержимом, желчном пузыре, в

объектах окружающей среды (смывы с различных предметов), в воде открытых

водоемов, сточных водах, гидробионтах и др.

Из современных методов индикации антигенов холерного вибриона наибольшее

распространение получила РНГА, чувствительность которой с антительными

эритроцитарными диагностикумами составляет 105—101' бактерий в 1 мл или

0,04 мкг/мл 0-антигена. При клинически выраженных формах холеры, когда в

испражнениях больных содержится огромное количество вибрионов (10'—109 в 1

мл), прямое исследование фильтратов прогретых на водяной бане испражнений в

РНГА с антительным диагностикумом позволяет дать ответ о наличии

специфического антигена уже через 2-—3 ч. Рвотные массы больных,

испражнения вибриононосителей и контактных лиц, содержащие меньшее

количество вибрионов, целесообразно исследовать после предварительного 6-

часового подращивания на 1% пептонной воде. При исследовании испражнений и

рвотных масс оказалось, что лишь в 52% случаев диагноз холеры был

подтвержден бактериологически у больных, в анамнезе значительной части

которых имелось указание на употребление антибиотиков при появлении первых

признаков заболевания. С помощью РНГА заболевания холерой удалось

дополнительно установить еще у 21 % больных [Поляков И. И. и др., 1973].

При исследовании испражнений, содержимого кишечника и желчного пузыря

умерших от острых кишечных заболеваний, испражнений здоровых лиц и проб

воды обычно в практических условиях наблюдали полное совпадение результатов

серологического и бактериологического методов исследования, что позволяет

считать РНГА с антительным эритроцитарным диагностикумом достаточно

надежным экспресс-методом при массовом обследовании на холеру.

Некоторыми авторами при индикации специфических антигенов холерного

вибриона отдается предпочтение РТНГА. Холерные диагностикумы для этой

реакции готовят из бараньих или человеческих О (I) группы эритроцитов,

сенсибилизированных холерными 0-антигенами. Чувствительность метода —

104—106 бактерий в 1 мл при исследовании нативных испражнений и 10'—105 —

после предварительного подращивания. Минимальное количество 0-антигена,

выявляемого с помощью РТНГА, равно 0,04—0,16мкг/мл. РТНГА дает

положительные результаты у 91% больных холерой, у 40% ре-конвалесцентов и

12% контактировавших с больными, 0-антиген холерного вибриона может быть

определен через 1 мес от начала заболевания в фекалиях у всех переболевших

людей, а спустя 5—6 мес — у половины обследованных, что, по-видимому,

свидетельствует о более длительной экскреции специфического антигена в

нежизнеспособной форме. Совпадение результатов бактериологического метода и

РТНГА, по различным данным, наблюдается в 63—100% случаев. Имеющиеся

материалы дают основание считать целесообразным широкое испытание РТНГА.

Положительную оценку при диагностике холеры получил МФА, позволяющий

выявлять холерные вибрионы при содержании их не менее 10° в 1 мл.

Использовать МФА целесообразно при исследовании нативного материала от

больных и трупов. У больных холерой положительные результаты с помощью МФА

были получены в течение 2 ч в 70—90% наблюдений при полном совпадении с

результатами бактериологического анализа. Применение МФА при исследовании

воды и смывов возможно лишь после предварительного подращивания или

концентрирования материала. Представляется перспективным использование

иммунотушевой окраски холерных вибрионов.

Для выявления антигенов холерного вибриона применяют агрегат гемаг-

глютинационную пробу (АГГ). В основе её лежит использование для агрегации и

фиксирования белков иммунной сыворотки на эритроцитах химического вещества

из группы диазосоединений в виде препарата диазоль черного С. Эритроциты,

сенсибилизированные агрегированными белками холерной 0-сыворотки, обладают

высокой специфичностью и чувствительностью. С их помощью удается определить

0,01—0,005 мкг/мл «цельного» растворенного антигена, приготовленного по

методу Буавена, и 4000—480 000 клеток холерного вибриона в микробных

взвесях. Это позволяет считать АГГ одним из наиболее чувствительных

иммунологических методов, который оправдал себя при обследовании людей. С

помощью АГГ 0-антиген холерного вибриона обнаружен в 88,2% больных холерой

и 78,3% вибриононосителей, причем в титрах 1 : 40 и выше 0-антиген

определен у 76,1% больных и у 57,1% вибриононосителей. Серологически

активный компонент эндотоксина обнаруживают в высоких титрах, чаще у

тяжелых больных и в первые 3—5 дней болезни. В период реконвалесценции

количество антигена в сыворотке крови снижается, но у 33% больных он

сохраняется до 20—25 дней [Покровский В. И., Малеев В. В., 1978]. Для

определения холерогена, помимо биопроб, используют и иммунологические

методы — РНГА и АГГ. В опытах с бесклеточными супернатантами культур

холерных вибрионов порог чувствительности обоих методов составлял

0,01—0,005 мкг/мл.

Антительный ответ. Инфицирование человека холерным вибрионом ведет к

местному и системному ответу. Клинически выраженное заболевание холерой

сопровождается ростом уровня сывороточных антимикробных (агглютинирующих и

вибриоцидных) и токсиннейтрализующих антител, как правило, уже к концу 1-й

недели после появления симптомов болезни. Агглютинины к холерному вибриону

к 4-му дню заболевания выявляют у 35,7% больных, на 8-й день — практически

у всех (98,6%). Уровень агглютининов достигает максимума на 2-й неделе

заболевания (на 11—15-й день титры, равные 320 и выше, регистрируют у 71%

больных), а затем резко падает. Титры вибриоцидных антител также

увеличиваются к 8—10-му дню заболевания и после 3 нед (иногда несколько

раньше) начинают снижаться, достигая первоначального уровня через 2—7 мес.

У детей до 4 лет падение титра вибриоцидных антител происходит быстрее, чем

в старшей возрастной группе (5—14 лет), достигая исходного уровня уже через

3 мес. Динамика титров токсиннейтрализующих антител имеет сходный характер

— появляясь в конце 1-й недели, они достигают максимума между 2-й и 3-й

неделями, а с 21-го дня снижаются.

Содержание сывороточных IgM и I gG на протяжении болезни сопоставимо с

аналогичными показателями в контрольной группе, хотя есть данные об

увеличении уровня IgM в острой стадии и снижении его в период

реконвалесценции. Некоторые исследователи не установили разницы в

содержании IgA при поступлении больных в стационар и в стадии

реконвалесценции; другие отмечают повышение его уровня у переболевших

[Покровский В. И., Малеев В. В., 1978; Адамов А. К., 1981]. Сказанное не

дает достаточных оснований утверждать, что изменение уровня сывороточных

иммуно-глобулинов при холере носит специфический характер.

Специфическая активность иммуноглобулинов различных классов зависит от

формы и длительности инфекционного процесса при холере. Антитела в

сыворотке крови переболевших относятся, преимущественно к IgM. У

вибриононосителей продуцируются, наоборот, высокоактивные IgG-антитела.

Активность IgA-антител в сыворотке крови вибриононосителей незначительно

выше по сравнению с больными. Чем тяжелее протекает заболевание, тем выше

активность продуцируемых антител, относящихся к иммуноглобули-нам класса М,

и ниже активность IgG-антител.

Самым простым и легко воспроизводимым методом определения антимикробных

антител является РА с живыми культурами холерного вибриона, но

чувствительность этой реакции ограничена. Диагностические титры (1 :

: 40 и выше) появляются, как правило, к концу 1-й недели заболевания, но

лишь у 19,7% больных холерой. Исследование парных сывороток, полученных с

интервалом 7—10 дней при наличии 4-кратного и более нарастания титров

антител увеличивает частоту положительных результатов до 89,6%

Гораздо большее значение придается в настоящее время выявлению виб-

риоцидных антител. Вибриоцидный тест (ВТ) является более чувствительным в

сравнении с РА, давая высокие титры, особенно у реконвалесцентов холеры (до

1 : 100 000). Нужно, однако, иметь в виду, что вибриоцидные антитела (титры

до 1 : 1000) могут обнаруживаться и в сыворотках невакцинированных здоровых

людей, никогда не болевших холерой, и у лиц, инфицированных бруцеллами,

Yersinia enterocolitica 09, цитробактером. Агглютинины относительно меньше

чувствительны к такой неспецифической стимуляции. Как и РА, ВТ позволяет

регистрировать подъем специфических антител (4-кратный и более) у 90—95%

больных с бактериологически подтвержденным диагнозом холеры [Watanabe Y.,

1974].

В качестве антигена в РА и ВТ используют холерные вибрионы обоих

серотипов. При необходимости пользоваться одним предпочтение отдают

серотипу Огава, который чаще, чем Инаба, вступает в перекрестные реакции с

гетерологичным серотипом холерного вибриона и реже дает неспецифические

реакции с микробами других семейств.

Хотя эти серологические реакции являются наиболее чувствительными,

необходимость применения в них живых вибрионов создает определенные

трудности при массовых обследованиях. Поэтому наибольшего внимания

заслуживают антигенные эритроцитарные диагностикумы, которые позволили

внедрить в практику РНГА и РТНГА. Эти реакции обладают достаточной

чувствительностью и специфичностью, позволяя обнаруживать антитела у

больных и переболевших холерой в титрах 1 : 640—1 : 1280. Наблюдаемые

различия в титрах при параллельном использовании РНГА и ВТ обусловлены

главным образом различиями в физико-химической природе выявляемых антител:

IgG-антитела более эффективно обнаруживают бактерицидным методом (ВТ), IgM-

антитела — в РНГА.

Для выявления антитоксинов в сыворотках применяют РН, результаты которой

учитывают по отсутствию холерогенного эффекта в перевязанной петле тонкой

кишки взрослых кроликов, в кишечнике крольчат-сосунков, на коже морских

свинок (кроликов) в опытах in vivo и по отсутствию цитото-нического

действия в культуре клеток СНО и Y-1 — в опытах in vitro. Наиболее

стандартизованы кожная проба и модель перевязанной кишечной петли. У 73%

больных в эндемичном по холере районе с помощью кожной пробы выявлено

диагностически значимое 9-кратное и большее увеличение титров

токсиннейтрализующих антител. Частота сероконверсии вибриоцидных антител и

агглютининов в этой же группе больных была выше и составила 98 и 88%

соответственно [Watanabe Y., 1974].

Анализ титров антитоксических антител при диареях нехолерной этиологии

показал, что в пробах сывороток, взятых в острой стадии болезни, они

колебались от << 10 до 270, но значимое нарастание титров в период рекон-

валесценции было отмечено лишь у 2,5% больных. Обладая высокой

специфичностью, метод определения токсиннейтрализующих антител несколько

уступает по чувствительности методам определения вибриоцидных и

агглютинирующих антител. Высокой разрешающей способностью обладают ИФМ и

РИМ, использующие меченный энзимом или радиоактивным веществом антиген и

позволяющие определять связывание 0,001—1 нг иммунного белка исследуемой

сыворотки.

Титры антитоксических антител, регистрируемые ИФМ, выше титров, которые

определяются с помощью внутрикожного теста, что обусловлено различиями в

выявляемых классах иммуноглобулинов: кожный тест документирует

нейтрализующую активность только IgG-антител, вероятно, в силу их большей

авидности, в то время как ИФМ регистрирует и уровень IgM-антител.

Таким образом, изучение титров и динамики нарастания циркулирующих

антител в сыворотках крови больных при холере расширяет возможности ее

лабораторной диагностики. Ретроспективный диагноз холеры с большей степенью

вероятности может быть установлен в РА и ВТ, но лишь на основании изучения

парных сывороток больных. Определение уровня антитоксина полезно в тех

случаях, когда необходимо исключить предшествующую специфическую

вакцинацию, так как антитела этого типа не индуцируются существующими

холерными вакцинами и очень редко встречаются у здоровых людей. Однако

подъем антитоксических титров у больных на фоне диагностически значимой

сероконверсии вибриоцидных и агглютинирующих антител повышает достоверность

серологической диагностики холеры.

Возникновение патологического процесса, вызванного холерными вибрионами,

ведет к появлению антител к этим микроорганизмам и во внешних секретах

пищеварительного тракта — интестинальной жидкости (ко-проантитела) и слюне.

Отличительной чертой динамики копроантител является их раннее появление (у

72% — на 2—3-й день болезни, у 100% — на 4-й день) и быстрое исчезновение

из кишечного содержимого. В интестинальной жидкости выздоравливающих от

холеры людей антитела против вибрионов относятся к иммуноглобулинам A, G и

М, но преобладающими являются SIgA-антитела, количество которых у больных

холерой возрастает примерно в 30 раз, но составляет около '/4 того, что

наблюдается у больных диарейными заболеваниями нехолерной этиологии.

Последнее связано с адсорбцией SIgA на холерных вибрионах, что приводит к

стойкому снижению количества вибрионов в стуле больных и сокращает

продолжительность их выделения из кишечника. Концентрация этого

иммуноглобулина и время его появления в кишечном содержимом не связаны с

сывороточным IgA. Количество IgG- и IgM-антител в кишечном содержимом

реконвалесцентов холеры также увеличивается (в 5—7 раз), но в фекалиях

антитела класса IgM не обнаруживают.

Для обнаружения антител в интестинальной жидкости и фекалиях больных

могут быть использованы ВТ, РИМ с холерными антигенами, меченными

радиоактивным йодом, непрямой флюоресцентно-серологический метод.

Нарастание специфических антител указывает на наличие заболевания холерой.

Однако кишечно-копрологическая диагностика холеры еще недостаточно

разработана.

В слюне больных и вибриононосителей повышен уровень IgA и IgG.

Одновременно появляются и специфические антитела (агглютинины), содержание

которых у больных холерой выше, чем у виброноносителей (30 АЕ и 14 АЕ

соответственно). Диагностический титр специфических агглютининов слюны

может оказаться значительно ниже сывороточного.

Определению состояния повышенной чувствительности при холере в реакции

ГЗТ посвящены единичные работы. Описаны положительные аллергические реакции

у 89% переболевших холерой и вибриононосителей (при отсутствии их в

контрольной группе) в ответ на внутрикожное введение аллергена из убитых

холерных вибрионов. Однако имеющихся данных недостаточно, чтобы высказать

суждение об аллергической перестройке организма при холере или о

диагностической значимости применяемых тестов.

Иммунитет

После болезни у человека вырабатывается выраженный иммунитет, который

сохраняется длительное время, поэтому случаи повторных

заболеваний холерой крайне редки. Опыты на добровольцах показали, что в

течение 3 лет (срок наблюдения) люди, переболевшие холерой в результате

экспериментального заражения, оставались устойчивыми к повторному заражению

холерными вибрионами [Levine M. et al., 1981].

Основная роль в иммунитете к холере принадлежит антителам, продуцируемым

местно (в кишке), хотя определенный вклад в защиту вносят циркулирующие

антитела при высоких их концентрациях, когда они проникают в просвет кишки

из крови, что подтверждено экспериментами на животных. Более высокий

уровень защиты наблюдается при синергическом действии антибактериальных и

антитоксических антител в кишке. Основная роль антибактериальных SIgA

состоит в том, чтобы препятствовать хемотаксису вибрионов к эпителию и

прилипанию их к поверхности слизистой оболочки кишечника в результате

блокирующего действия на структуры для прилипания (лиганды) на поверхности

бактериальных клеток. Снижение колонизации и адгезии холерных вибрионов

способствует более быстрому их выведению из кишечника при перистальтике и

тем самым уменьшает возможность приживления возбудителя в кишечном тракте.

Действие кишечных IgA-антител против холерогена обусловлено главным

образом блокадой его В-субъединицы, что препятствует связыванию токсина с

ганглиозидом GM1 на поверхности эпителиоцитов. Антитела, блокирующие

токсический сайт на А-субъединице холерогена, оказывают меньшее защитное

действие.

Список использованной литературы

1. Л.Б. Хазенсон, Н.А. Чайка: Иммунологические основы диагностики и

эпидемологического анализа кишечных инфекций. «Медицина»,1987.

2. В.Д. Тимаков, В.С. Левашев, Л.Б.Борисов: Микробиология. «Медицина»,

1983.

3. Лекция по теме.

4. Методическая разработка кафедры.