Хламидиоз. Методы определения/диагностики

| |

|ХЛАМИДИОЗ - СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ И ЛЕЧЕНИЮ |

|Цитоскопические методы обнаружения хламидий |

|При цитоскопическом методе одновременно с поиском |

|цитоплазматических клеток-включений Провачека учитывается |

|количество лейкоцитов как показателя воспаления, а также |

|дополнительная информация о наличии сопутствующей |

|бактериальной микрофлоры, дрожжеподобных грибов, трихомонад|

|и т.п. |

|Показания: Острая фаза заболевания. |

|Материалом для исследования служат соскобы из уретры у |

|мужчин и уретры и /или цервикального канала у женщин. |

|Материал берут специальными щеточками или ложечками |

|Фолькмана. Выделения из цервикального канала удаляются |

|ватным тампоном. Щеточка вводится в канал на 1-2 см, |

|вращается 15 секунд . Соскобный материал распределяется на |

|предметном стекле, высушивается на воздухе и фиксируется в |

|метаноле или холодном ацетоне. Наиболее популярна окраска |

|по Романовскому-Гимзе. После окраски препараты |

|просматриваются в световом микроскопе, используя |

|иммерсионный объектив (х90). При этом цитоплазма клеток |

|окрашивается в голубой цвет, ядра в фиолетово-синий, |

|цитоплазматические включения определяются в виде |

|темно-синих или розовых микроколоний на фоне голубой |

|цитоплазмы. На стадии элементарных включения хламидий |

|окрашиваются в розовый цвет, на стадии элементарных телец |

|-в синий. |

|Цитоскопический метод широко доступен, но эффективен лишь |

|при острых формах инфекции, значительно менее эффективен и |

|информативен при хронических формах заболевания При |

|урогенитальном хламидиозе частота обнаружения телец |

|Провачека в соскобах уретры и цервикального канала не |

|превышает 10-12 %. Наличие этих телец подтверждает диагноз |

|хламидиоза, однако их отсутствие не исключает наличие |

|инфекции. |

| |

| |

|Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) |

|Этот метод предусматривает прямое выявление антигенов |

|хламидий. При люминесцентной микроскопии включения хламидий|

|определяются в виде зеленой или желто-зеленой флюоресценции|

|включений на коричнево-оранжевом фоне цитоплазмы клеток |

|Включения могут иметь зернистую гомогенную или смешанную |

|структуру. |

|Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим |

|методом являются: |

|1.Острая фаза заболевания. |

|2.Хроническая фаза заболевания |

|3 Установление этиологии хронического инфекционного |

|процесса урогенитального тракта |

|4. Беременность с отягощенным акушерским анамнезом |

|5. Бесплодие неясного генеза. |

|Диагностическая информативность ПИФ связана с тем, что с ее|

|помощью выявляются не только корпускулярные, но и |

|растворимые антигены хламидий Этот метод не зависит от |

|возможного изменения тинкториальных свойств микроорганизма |

|в процессе заболевания и лечения. ПИФ-метод является |

|важнейшим скриннинговым методом диагностики урогенитального|

|хламидиоза. Его чувствительность и специфичность при |

|использовании моноклональных антител составляет |

|соответственно 65-90% и 85-90%. При оценке результатов |

|следует учитывать, что только показатели внутриклеточной |

|флюоресценции могут оцениваться в качестве положительного |

|результата этого теста при использовании поликлональных |

|антихламидийных антител, при использовании моноклональных -|

|результат считают при наличии 10 ЭТ в поле зрения. |

|Соскобные препараты готовят также, как и для |

|цитоскопических исследований. |

|Выпускают диагностические наборы, содержащие моноклональные|

|антитела для ПИФ, следующие фирмы: Syva, Drfco, Kallastad, |

|Bartrels, Boots celltech, California Integrated |

|Diagnostics, Orion Diagnostica. Реагенты фирм Syva, Difco, |

|Kallastad представляют собой меченные ФИТЦ моноклональные |

|антитела к основному белку наружной мембраны хламидий, а |

|реагенты других фирм - моноклональные антитела к |

|родоспецифическому хламидийному липолисахариду (ЛПС). В |

|России ЗАО “НИАРМЕДИК плюс” при НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН|

|выпускает моноклональные антитела к ЛПС хламидий, которые |

|успешно конкурируют с продукцией иностранных фирм по |

|качеству продукции. Это набор “Хламоноскрин” для |

|определения моноклональных антител к родоспецифическому |

|липополисахаридному антигену и набор “Хламоноскрин-2” для |

|определения моноклональных антител к видоспецифическому |

|белковому антигену хламидий трахоматис. Наборы имеют ФС |

|42-359598 и регистрационное удостоверение Минздрава России |

|93/ 270/ 9 . |

|Моноклональные антитела отличаются друг от друга по |

|вызываемой яркости свечения, постоянству выявляемых форм ЭТ|

|и степени специфичности. Для диагностики хламидий этим |

|методом необходим люминесцентный микроскоп. |

|В целом, метод ПИФ отвечает критериям высокой |

|чувствительности и специфичности, но требует исполнения |

|опытным, компетентным лабораторным работником. |

|Высококвалифицированная экспертная оценка методом ПИФ редко|

|бывает доступной, поэтому средняя чувствительность его |

|снижается. Метод недостаточно чувствителен и для |

|стабильного определения малых количеств ЭТ. К тому же |

|невозможно проверить и отрицательные результаты, и, |

|следовательно, обнаружить среди них ложноотрицательные, что|

|приводит к снижению чувствительности. |

| |

| |

|Иммуноморфологические методы |

|Эти методы основаны на обнаружении антигенных субстанций |

|хламидий в эпителии и других тканях путем обработки |

|препаратов специфическими антителами. Антитела |

|диагностической антихламидийной сыворотки соединены с |

|какой-либо меткой - люминесцирующей (ФИТЦ-антитела) или |

|ферментной (энзим-меченые антитела). |

| |

| |

|Непрямой метод иммунофлюресценциии |

|Непрямой метод иммунофлюресценции применяют в тех случаях, |

|когда нет в наличии ФИТЦ-конъюгата антихламидийных антител.|

|В этих случаях приготовленный тем же методом, что и для ПИФ|

|препарат из клинических проб обрабатывают вначале |

|антихламидийными антителами, полученными путем иммунизации |

|хламидиями овец, кроликов, мышей или других животных, а |

|затем второй сывороткой, специфичной для вида животного, |

|которое было иммунизировано хламидиями. Антитела второй |

|сыворотки конъюгированы с ФИТЦ. Показания к применению и |

|специфичность данного метода совпадают с ПИФ. |

| |

| |

|Диагностика хламидий на культуре клеток МсСоу |

|Одним из лучших, но в то же время наиболее трудоемким |

|является метод диагностики хламидий путем изоляции |

|возбудителя на культуре клеток, обработанных различными |

|антиметаболитами (“золотой стандарт”) Для этой цели обычно |

|используют чувствительную культуру клеток, обработанную |

|циклогексимидом. Чувствительность культурального метода по |

|сравнению с ПЦР составляет 70-80%, но в то же время он |

|превосходит молекулярно-биологические методы диагностики по|

|специфичности. В литературе описаны случаи выявления |

|хламидий трахоматис методом ПЦР при отрицательных |

|результатах культурального теста и наоборот. |

|Показаниями для диагностики хламидийной инфекции этим |

|методом являются: |

|1 Беременность с отягощенным акушерским анамнезом. |

|2. Оценка эффективности проведенного антибактериального |

|лечения. |

|3. Выявление чувствительности и резистентности к |

|антибактериальным |

|препаратам. |

|4. Выявление хламидий у ВИЧ-инфицированных или лиц со |

|вторичными иммунодефицитными состояниями (онкологические |

|больные после проведенных курсов лучевой и химиотерапии, |

|трансплантации костного мозга; лица, получающие |

|иммунодепрессанты; больные вирусным гепатитом и |

|туберкулезом). |

|5. Бесплодие неясного генеза. |

|6. Установление этиологии хронического инфекционного |

|процесса урогенитального тракта. |

|Культуральный посев является референс-методом при оценке |

|эффективности антибактериального лечения. При исследовании |

|биопроб методом ПЦР после курса химиотерапии в некоторых |

|случаях можно получить “ложноположительные с клинической |

|точки зрения” результаты. Это связано с тем, что невозможно|

|однозначно оценить жизнеспособность и патогенность |

|микробной клетки на основании выявления фрагмента ее |

|генома, используя только данные молекулярно-биологических |

|методов. В этом случае при исследовании клинического |

|материала с помощью культурального посева микробные клетки,|

|потерявшие эти важные с клинической точки зрения свойства, |

|не дадут роста в клеточной культуре. |

|Для транспортировки и хранения клинического материала |

|используют специальную питательную среду (транспортная |

|среда). Она разливается в пенициллиновые флаконы по 1 мл и |

|хранится при температуре + 4 ° С (в общей камере бытового |

|холодильника) в течение 2-х месяцев. Состав транспортной |

|среды: среда MEM с добавлением 10% сыворотки крупного |

|рогатого скота и антибиотика гентамицина концентрации 50 |

|мкг/мл . |

|Клинический материал после перенесения в транспортную среду|

|хранится в общей камере холодильника при температуре + 4 ° |

|С и, в течение двух суток должен быть доставлен в |

|лабораторию. |

|Процедура посева |

|1. Обработка однодневной клеточной культуры МсСоу 1% |

|раствором ДЕАЕ декстраном в течение 30 минут. |

|2. Заражение обработанных клеток материалом, полученным от |

|больных. |

|3. Центрифугирование зараженных клеток при 2500 g в течение|

|45 минут. |

|4. Отмывка клеток питательной средой. |

|5. Добавление к клеткам ростовой среды, содержащей |

|циклогексимид. |

|6. Инкубирование клеток в течение двух суток при +36 ° С. |

|7. Обнаружение хламидий в клетках методом прямой |

|иммунофлюоресценции или ПЦР. |

|Реальный срок получения результатов этим методом - семь |

|дней. |

| |

|В настоящее время в литературе растет число сообщений о |

|случаях резистентности хламидий к антибактериальным |

|препаратам (эритромицину, тетрациклину, доксициклину, |

|фторхинолонам). Ценность культурального метода состоит в |

|том, что он является пока единственным методом, позволяющим|

|выбрать антибактериальный препарат для лечения хламидийной |

|инфекции и оценить эффективность антибактериальной терапии.|

Страницы: 1, 2