всей спектриновой сетью, это исключило бы возможность латеральных

перемещений самого белка, образования кластеров и транспортных функций.

Связь спектрина с мембраной осуществляется, вероятно, не только через

анкирин, но также с помощью дополнительных взаимодействий. Имеющиеся на

сегодняшний день данные свидетельствуют о том, что белок 4.1 обеспечивает

связь спектрина с интегральным белком мембраны. [5] Все перечисленные

дополнительные взаимодействия носят слабый характер и, видимо, играют

второстепенную роль по сравнению со взаимодействием спектрин-анкирин-белок

3.

Белок полосы 4.1 Необходим для нормальной стабилизации мембраны,

закрепляет связь спектрина с актином. На электрофореграмме данный белок

разделяется на две полосы: 4.1а (Mr=80 kD) и 4.1b (Mr=78 kD). Переход 4.1а

в 4.1b осуществляется с помощью деамидирования. Это глобулярный белок с

мол. массой 80 kD, составляющий около 5% от белковой массы цитоскелета

эритроцитов. Его изоформы сходны по аминокислотному составу. Обе изоформы

способны взаимодействовать со спектрином. Каждая из них содержится в

количестве примерно 100 000 молекул на 1 клетку. [5]

Белок полосы 4.2 Паллидин – это олигомер (Mr=72 kD), в клетке

присутствует в димерной и тримерной формах с Mr=185 kD. Соединяется с

цитоплазматическим доменом белка полосы 3, анкирином, спектрином и белком

полосы 4.1. [14]

Белок полосы 4.5 В его состав входят интегральные белки – переносчики

нуклеозидов и глюкозы через эритроцитарную мембрану. Основная часть белков

полосы 4.5 представлена транспортерами глюкозы (Mr=55 kD). [14]

Белок полосы 4.9 Центральный компонент цитоскелета с Mr=48 kD. Этот белок

выделен в виде тримера с Mr=145 kD. Стабилизирует взаимодействия спектрина

с актином и влияет на степень его полимеризации. Это фосфопротеин. Белок

присутствует в эритроцитах в количествах, приблизительно равных количеству

спектрина. О функциях этого белка практически ничего не известно. Возможно,

он принимает участие в укреплении цитоскелетного каркаса (сети

цитоскелета). Показано, что очищенный полипептид полосы 4.9 может

взаимодействовать с актиновыми нитями, снижая скорость полимеризации актина

и, возможно, стабилизируя короткие актиновые нити в эритроцитах. [5]

Полоса 5 Актин – представлен в эритроцитах (-изоформой и по физико-

химическим свойствам схож с актином поперечнополосатых мышц. Так как

функциональной формой актина является его полимер, изначально пытались

выяснить, есть ли в эритроцитах филаментный актин. Электронно-

микроскопические исследования показали, что актин присутствует в

эритроцитах в виде филаментов, содержащих от 12 до 17 мономеров актина. [5]

Выделенные мембраны эритроцитов, а также комплекс спектрина, актина и белка

4.1 способны индуцировать полимеризацию мономерного актина, подобно

олигомерам актина. Обработка цитохалазином В подавляет полимеризацию. Так

как типичный фибриллярный актин не выявляется в нативных эритроцитах, а в

опытах in virto можно индуцировать образование длинных филаментов,

связанных с мембраной, следует, по-видимому, предположить, что в

эритроцитах существуют какие-то механизмы, ограничивающие рост филаментов,

подобно тому, как это делает цитохалазин В. Актиновые олигомеры связываются

с N-концом молекулы спектрина латерально. Каждый тетрамер спектрина имеет

два сайта связывания для актиновых олигомеров. Спектрин может связываться с

Ф-актином по всей длине актиновой нити, и эти связи, видимо, существенны

для образования цитоскелетной сети. Важная роль во взаимодействии актина и

спектрина принадлежит белку полосы 4.1, который связывается со спектрином в

тех же участках, что и актин. Связь спектрина с актином в отсутствие белка

4.1 слабая и значительно усиливается в его присутствии, поэтому

взаимодействие спектрина и актина называют 4.1-зависимым. Комплексы белка

4.1, спектрина и актина обладают гораздо большей устойчивостью к

диссоциации при седиментации в сахарозе, чем комплексы актина и спектрина.

Возникает вопрос о том, какие факторы оказывают влияние на полимеризацию

эритроцитарного актина. Относительно низкая концентрация актина в

эритроцитах не может, вероятно, иметь решающего влияния на длину

филаментов. Предположим, что на полимеризацию актина могут влиять такие

актинсвязывающие белки, как спектрин и белок 4.1. Оказалось, что эти белки

способны регулировать скорость полимеризации актина, сокращая лаг-фазу,

уменьшая скорость элонгации и не вызывая при этом никаких изменений в

последовательности этапов полимеризации. Спектрин и белок 4.1 вызывают

нуклеацию глобулярного актина в условиях, когда концентрация актина ниже

критической и спонтанная полимеризация не происходит. Таким образом, можно

предположить, что спектрин и белок 4.1 представляют собой комплекс белков,

блокирующих медленный конец актиновой нити в отличие от большинства

"запирающих" белков, взаимодействующих с быстрым концом. Однако позже были

получены данные, которые противоречат этому предположению. Шен с соавторами

выделили фрагменты цитоскелета эритроцитов при обработке растворами с

низкой ионной силой при 37 (С. [5] Электронно-микроскопические исследования

полученных фрагментов показали, что часть из них содержит филаменты актина,

вдоль которых кластерами располагаются спектриновые молекулы. При инкубации

этих препаратов с глобулярным актином (при концентрации актина в растворе

выше критической) происходил рост актиновых нитей на обоих концах. Тсукита

с соавторами изучали полимеризацию актина на мембранах эритроцитов,

закрепленных на электронно-микроскопических сектах. При инкубации этих

препаратов с глобулярным актином на внутренней поверхности мембран,

содержащих цитоскелетные белки наблюдался рост актиновых филаментов. [5]

При концентрациях глобулярного актина, близких к критическим, рост

наблюдался только на медленном конце, а при дальнейшем увеличении

концентрации – на обоих концах нити. При обработке мембран "кэпирующим"

белком с мол. массой 45 kD, связывающимся с быстрым концом актиновых

микрофиламентов, рост наблюдался только на медленном конце. Данные Шена и

Тсукиты приводят к выводу о том, что в эритроцитах актин существует в виде

филаментов со свободными концами. Следовательно, спектрин и белок 4.1 не

являются кэпирующими белками, однако несомненно влияют на состояние актина

в эритроцитах, стабилизируя актиновые филаменты.

Белок полосы 6 Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД), молекулярная

масса составляет 35 kD. Располагается на цитоплазматическом домене

анионтранспортного белка, в составе мультиферментного комплекса. Данный

белок является ферментом гликолиза и принимает участие в регуляции

окисления гемоглобина. [14]

Полоса 7 Основной составляющей полипептид – тропомиозин. Долгое время

оставалась неизвестной природа белка зоны 7. Было показано, что этот белок

связывается с антителами к тропомиозину, выделенному из мускульного желудка

цыпленка. Молекулярная масса белка совпадала с молекулярной массой

тропомиозинов, выделенных из мозговых тканей, из макрофагов и кровяных

пластинок. Тропомиозин эритроцитов – димер с мол. массой 60 kD, состоящий

из двух субъединиц с мол. массой 29 и 27 kD и связывающийся с мышечным

актином (Ф-актином) при соотношении: 1 молекула тропомиозина на 6-7

мономеров актина. Так как в эритроцитах филаменты актина содержат до 15-17

мономеров, они могут связывать две молекулы тропомиозина. [5]

Полоса 8 Представлена пептидной частью фермента глутатион-S-трансферазы

(Mr=23 kD). Взаимосвязь белка полосы 8 с мембраной является кальций –

зависимой.

В 1985 г. было показано, что еще одним компонентом цитоскелета

эритроцитов является миозин. С помощью моноклональных антител к тяжелой

цепи миозина Фаулер обнаружил в эритроцитах полипептид, который был выделен

и охарактеризован. Белок состоит из тяжелой цепи с мол. массой 200 kD и из

двух легких цепей с мол. массами 26 и 19,5 kD. В растворах с низкой ионной

силой он образует биполярные филаменты и обладает АТФазной активностью. В

эритроцитах миозин присутствует примерно в количестве 6000 молекул на 1

клетку, т.е. на 1 молекулу миозина, как и в других клетках, приходится

около 80 мономеров актина. [5]

Белки, образующие цитоскелет эритроцитов, неуникальны. Они или им

подобные белки есть во многих других клетках. Преимущественная их

локализация – вблизи мембран. Вероятно также, что рассмотренные белки могут

быть полифункциональны и использоваться в структурных комплексах разного

функционального назначения. [5]

Полосу 9 на электрофореграмме составляет белок глобин, который является

частью мембрансвязанного гемоглобина. Как уже говорилось выше,

цитоплазматический домен белка полосы 3, включающий около 380

аминокислотных остатков, локализован в цитоплазме и играет важную роль в

поддержании формы эритроцита и его метаболизме. N-концевая

последовательность цитоплазматического домена богата аминокислотными

остатками кислого характера. На этом участке находятся центры связывания

гидролитических ферментов – глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы,

альдолазы, каталазы, гемоглобина и гемихрома. Таким образом,

цитоплазматический домен анионтранспортного белка и является местом

локализации мембрансвязанного гемоглобина, о структуре, свойствах и

некоторых аспектах функционирования которого будет сказано ниже.

Гемоглобин Гемоглобин – белок эритроцитов, красных кровяных клеток,

переносящий молекулярный кислород от легких к тканям в организмах

позвоночных животных. Гемоглобин можно считать своего рода модельным

белком, структура, свойства и функции которого наиболее полно изучены по

сравнению с другими белками на протяжении последних 50 лет. Американский

физик Хопфилд назвал его атомом водорода современной биохимии, имея в виду,

что изучение гемоглобина сыграло в биохимии ту же роль, что и изучение

атома водорода в физике. Гемоглобин называют также почетным ферментом,

поскольку исследования его структуры в статике и динамике позволили

значительно продвинуться в понимании механизмов функционирования ферментов.

Структура этого глобулярного белка известна в деталях главным образом

благодаря работам английского биофизика Макса Перутца, который получил

первые рентгеноструктурные данные еще в конце 40-х годов нашего века. За

эти исследования он был удостоен Нобелевской премии.

Структура гемоглобина Молекула гемоглобина состоит из четырех субъединиц:

двух ( и двух ( - и соответственно содержит четыре полипептидные цепочки

двух сортов. Каждая (-цепочка содержит 141, а (-цепочка – 146

аминокислотных остатков. Таким образом, вся молекула гемоглобина включает

574 аминокислоты. Хотя аминокислотные последовательности (- и (-цепочек

различны, они имеют практически одинаковые третичные пространственные

структуры. Собственно говоря, приведенные выше детали структуры относятся

не к гемоглобину, а к его белковой компоненте – глобину. Каждая субъединица

гемоглобина содержит одну небелковую (так назваемую простетическую) группу

– гем. Гем представляет собой комплекс Fe(II) с протопорфирином. Структура

гема представлена на рис.1, а. [2]

Атом железа может образовать шесть координационных связей. Четыре связи

направлены к атомам азота пиррольных колец, оставшиеся две связи –

Рис.1. Структура гема (а), структура активного центра дезоксигемоглобина

(б), структура активного центра оксигемоглобина (в).

перпендикулярно к плоскости порфиринового кольца по обе его стороны. Гемы

расположены вблизи поверхности белковой глобулы в специальных карманах,

образованных складками полипептидных цепочек глобина. Гемоглобин при

нормальном функционировании может находиться в одной из трех форм:

феррогемоглобин (обычно называемый дезоксигемоглобином или просто

гемоглобином), оксигемоглобин и ферригемоглобин (называемый также

метгемоглобином). В феррогемоглобине железо находится в закисной форме

Fe(II), одна из двух связей, перпендикулярных к плоскости порфиринового

кольца, направлена к атому азота гистидинового остатка, а вторая связь

Страницы: 1, 2, 3, 4, 5