|
весь опыт нужно переставить с новой порцией крови. Пробирки с исследуемыми
культурами выдерживают в термостате при 37 °С в течение суток. Учет
результатов проводится обязательно дважды: через 2—3 ч и 24 ч. Учитывают
свертывание плазмы и образование сгустков. Обычно культуры, активно
продуцирующие коагулазу, дают положительную реакцию уже через 2—3 ч. а если
они обладают и выраженной фибринолитической активностью, то первоначально
образовавшиеся сгустки могут подвергнуться расплавлению к концу суток.
Слабокоагулирующие штаммы могут давать положительную реакцию в поздние
сроки—к концу суток. Опыты, давшие сомнительный результат, необходимо
повторить.
Некоторые исследователи, получив отрицательный или сомнительный
результат, оставляют пробирки на столе. Этого делать нельзя, так как
свертывание плазмы в более поздние сроки может носить не специфический
характер и его не следует принимать во внимание.
Стафилококки, дающие положительную коагулазную пробу, должны
рассматриваться как потенциально патогенные, независимо от наличия или
отсутствия у них гемолитических свойств и характера пигмента, их относят к
виду St. aureus и в дальнейшем подвергают фаготипизации и проверке на
чувствительность к антибиотикам.
Углубленное изучение стафилококков показало, что основной признак па-
тогенности — коагулазная реакция может подвергаться изменчивости при
воздействии различных факторов (Г. Н. Чистович, 1961; Е. М. Падерина,
1966), поэтому в ряде случаев, при выделении коагулазонегативных
стафилококков в монокультуре из патологических очагов, целесообразно
изучить у них другие признаки потенциальной болезнетворности и прежде всего
— способность ферментировать маннит в анаэробных условиях. Известно, что
среди коагулазоотрицательных часть культур обладает способностью расщеплять
маннит в анаэробных условиях (8,4% —по данным А. А. Акатова и М. Л.
Хатеневер, 1974).
Определение ферментации маннита в анаэробных условиях технически очень
просто и осуществляется путем посева уколом исследуемых культур в пробирки
с высоким столбиком полужидкого агара Хоттннгера, содержащего 1% маннита и
0,004% индикатора бромкрезолпурпура или бромтимолблау (рН == 7,2). Эту
среду перед посевом «регенерируют», т. е. кипятят в водяной бане, быстро
охлаждают, а после посева заливают слоем стерильного вазелинового масла.
Посевы инкубируют при 37 °С в течение 5 дней. Однако в значительном числе
случаев результаты могут быть учтены уже через сутки.
Наряду с реакцией плазмокоагуляции, большое значение приобрела еще одна
важная способность стафилококков, характеризующая их потенциальную
патогенность, —дезоксирибонуклеазная активность. Многие исследователи
сообщают о высокой корреляции этого признака с коагулазной активностью и
токсигенностью изучаемых культур; отмечают, что стафилококки, выделенные из
патологического материала, как правило, обладают ДНК-азой. Коагула-
зопозитивные штаммы, полученные от носителей, могут не иметь этого
фермента, и обычно отсутствие дезоксирибонуклеазной активности сочетается с
низкой биохимической способностью и атоксигенностью таких культур
стафилококков.
По наблюдениям некоторых исследователей, среди коагулазонегативных
штаммов стафилококков, но обладавших другими признаками патогенности,
выделенных в ряде случаев от больных с различными гнойными инфекциями,
дезоксирибонуклеазную активность проявляли от 10 до 29% таких культур (И.
И. Панышева и сотр., 1967; Franklin и соавт., 1966; Lierd и Golde, 1970).
В настоящее время этот тест может служить надежным дифференциальным
признаком между патогенными и непатогенными стафилококками и в то же время
может помочь в дифференциации степени патогенности коагулазопозитивных
штаммов и, безусловно, привлечет внимание к коагулазонегативным, но
обладающим этим ферментом культурам стафилококков и в ряде случаев позволит
отнести последние к болезнетворным формам с большей уверенностью.
Методика определения дезоксирибонуклеазной активности несложна, в
основу ее положен метод Джеффриса. Готовят впрок 2% МПА (рН—8,6),
содержащий ДНК (2 мг/мл среды), разливают по флаконам и стерилизуют текучим
паром в течение 30 мин. Перед разливом в чашки к среде добавляют CaCIa (0,8
мг/мл). На подсушенную среду засевают суточные культуры стафилококков.
После инкубации в течение 18—20 ч при 37°, на поверхность среды наливают IN
раствор НС1 и через 7—10 мин учитывают зоны просветления, которые оценивают
крестами (Н. Б. Мордвинова и соавт., 1967).
Нами предложен более экономичный метод для обнаружения ДНК-азы у
микроорганизмов. Этот способ, помимо уменьшения в 2 раза расхода ДНК на
каждый опыт, позволяет использовать более дешевую низкополимерную
нуклеиновую кислоту, изготовляемую Олайнским заводом химических реактивов.
Предлагаемая методика широко апробирована на кафедре микробиологии ЛСГМИ и
по качеству результатов не уступает общепринятой. Поэтому мы приводим ее
подробное описание.
Для приготовления рабочего раствора ДНК, навеску нуклеиновой кислоты из
расчета 10 мг/мл помещают в дистиллированную воду, добавляют 0,5 мл 0,2%
(или 0,8%) раствора NaOH на каждые 10 мл воды. Для лучшего растворения ДНК
смесь либо нагревают до кипения в водяной бане при постоянном перемешивании
стеклянной палочкой, либо оставляют на ночь при 37 °С в термостате. К
расплавленному и остуженному до 50 °С МПА добавляют рабочий раствор ДНК из
расчета 1 мг/мл (на 9 мл МПА—1 мл раствора ДНК), перемешивают, разливают
по10л(л в пробирки, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или в
автоклаве при 0,5 атмосферы в течение 20 мин. Срок хранения— 1—2 мес.
При постановке опыта столбики агара с ДНК растапливают, в водяной бане
добавляют 0,1 мл официнального стерильного 10% р-ра СаСЬ, перемешивают и
выливают на слой хорошо подсушенного питательного агара в чашки Петри и
вновь подсушивают. Суточную агаровую культуру засевают маленькими бляшками
(диаметр равен 2—2,5 мм) или штампом-репликатором не более 20—25 бляшек, во
избежание слияния зон деполимеризации ДНК. После 18—20-часовой инкубации
поверхность агара заливают 5 мл IN раствора НС1 и через 3—5 мин учитывают
зоны просветления. Реакции оценивают в крестах.
При этом следует учесть, что интенсивность зоны деполимеризации на
плотной среде не всегда совпадает с количеством продукции этого фермента у
исследуемых стафилококков в жидких средах.
Для обнаружения фибринолизина используют несколько усовершенствованный
метод Кристи с сотр.
Среда Кристи—Чепмена имеет следующий состав: мясной экстракт—0,45 г,
пептон—0,75 г, хлористый натрий—1,2 г, агар—2,75 г, вода—130 мл, рН среды
== 7,0. Стерилизуется в автоклаве и сохраняется впрок.
Перед опытом среду растапливают, остужают до 50 °С и добавляют 15—20%
стерильной цитратной человеческой плазмы. Смесь прогревается в водяной бане
при 65—70°С в течение 2— 5 мин до появления ясной мути, а затем разливается
в чашки. Испытуемые культуры засевают «пятнами» по 15—20 на чашку.
Посевы инкубируют при 37 °С. Учитывается
образование зон просветления вокруг колонии первоначально через 14 ч, затем
через 24 и 48 ч, так как реакция у различных культур течет неодинаково
быстро и у ряда штаммов она развивается в более поздние сроки.
Фибринолитический тест мы считаем весьма пригодным для определения
потенциальной болезнетворности стафилококков, но оцениваем только в
комплексе с другими признаками активности.
Гиалуронидазная активность определяется по методу Мак-Клина в
модификации М. Ш. Могилевского и Л. С. Коган (1949).
Раствор гиалуроната дающий в присутствии 2 N уксусной кислоты типичный
сгусток, разливается по 0,5 мл в стерильные пробирки. Добавляется 0,5 мл
суточной культуры стафилококка в пептонной воде. Контролями служат:
гиалуропат + дистиллированная вода и гиалуропат + незасеянная среда. Смеси
встряхиваются и выдерживаются при 37 °С 15—20 мин. Затем в каждую пробирку
добавляется по две капли 2 N раствора уксусной кислоты и встряхивается. В
контролях должен образоваться слизистый комочек. В опыте при наличии
гиалуронидазы он отсутствует, что свидетельствует о деполимеризации
гиалуроновой кислоты микробным ферментом.
Для изучения токсигенности стафилококков удобно пользоваться методом,
предложенным Илеком и Леви (1950), позволяющим определить типы гемолизинов.
С этой целью готовятся чашки с питательным агаром, содержащим 5%
отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана, кролика и человека.
На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную
полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой.
Отступив 1—2 мл от края полоски, перпендикулярно к ней засеивают штрихами
исследуемые культуры. Посевы инкубируют при 37 °С в течение суток, после
чего учитывают результаты.
Альфа-гемолиз проявляется в виде полного просветления среды вокруг
штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Он
выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами
Бета-гемолиз на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление,
зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это «тепло-холодовый»
токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания
чашек в холодильнике при температуре +4 °С по характерному послойному
гемолизу бараньих эритроцитов и не централизуется альфа-антитоксической
сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен. Дельта-гемолизин
определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не
нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Однако образование дельта-
гемоли-зина на этих чашках может быть замаскировано действием альфа-токсина
и поэтому его следует проверять на средах с эритроцитами человека или
лошади. Таким образом, для определения всех 3 типов гемолизинов достаточно
использовать эритроциты барана и человека или лошади.
Для определения вирулентности стафилококков существуют несколько
различных методов заражения белых мышей.
Наиболее простым является введение 0,1 мл суточной бульонной культуры
испытуемого стафилококка в хвостовую вену. Учет гибели животных
осуществляется в течение 10 суток, регистрируют наличие абсцессов в почках.
Удобно пользоваться способом Badenski и сотр. (1958), Суточная
бульонная культура центрифугируется при 3000 об/мин — 30 мин. Полученный
осадок ресуспендируется в половинном объеме декантата и в количестве 0,05
мл вводится 6 мышам позади глазного яблока в окологлазничную клетчатку.
Культуру, вызывающую гибель половины и более зараженных мышей в течение 6
дней, считают вирулентной.
При этих методах заражения вирулентной культурой у животных развивается
общин септический процесс с преимущественным поражением почек. Основная
гибель мышеи происходит на 3—5-й день после заражения.
Другие способы заражения белых мышей (внутрибрюшинный и интраназальный)
требуют в десятки
раз большей заражающей дозы, максимум гибели мышей приходится на 1—2-е
сутки, что характеризует преимущественно токсический компонент процесса (С.
А. Анатолий, И. И. Антоновская, 1967).
В то же время ряд исследователей отдают предпочтение более простому
технически внутрибрюшинному способу заражения мышей, который одновременно
позволяет изучать клеточные и гуморальные механизмы развития инфекции.
Сопоставление вирулентности стафилококков для белых мышей с отдельными
факторами их патогенности показало, что вирулентность штаммов, по данным
большого числа исследователей, коррелирует с уровнем альфа-гемотоксина. Что
касается других признаков патогенности и их корреляции с вирулентностью, то
получены разноречивые сведения. Так, по данным С. А. Анатолия (1969),
вирулентность штаммов коррелировала с продукцией бета-гемолизина,
летального фактора, лецитовителлазы, гиалуронидазы и коагулазы. А. К.
Акатов (1968) не отмечает корреляции вирулентности с коагулазной,
лециговител-лазной, фибринолитической активностью, не установлена
корреляция с дельта-токсигенностью.
Для сравнения вирулентности стафилококковых культур можно использовать
их способность вызывать дермонекротическую реакцию у кроликов.
Готовят 4-миллиардную взвесь суточной агаровой культуры стафилококка в
физиологическом растворе, а из полученной густоты делают разведения, чтобы
получить 2- и 1-миллиардные взвеси. Из каждого разведения в объеме 0,1 мл,
что составляет 100, 200, 400 миллионов микробных тел, вводят кролику в
выстриженную или депилированную накануне кожу. На одном кролике можно
одновременно поставить до 8 внутрикожных проб. Ежедневно отмечают
проявления дермонекротической реакции, а окончательно на 4-е сутки. За
минимальную дермонекротическую дозу принимают то наименьшее количество
культуры, которое дает некроз на 4-е сутки (Г. В. Выгодчиков, 1963).
Список использованной литературы
1. А.М.Смирнова, А.А.Трояшкин, Е.М.Падерина: микробиология и
профилактика стафилококковых инфекций – «Медицина», 1977.
2. Стафилококковые инфекции: российский сб. науч. тр. – С.-П., 1991.
3. А.М.Смирнова: вопросы иммунологии и микробиологии стафилококковых и
стрептококковых инфекций – Ленинград, 1975.
4. Лекция по теме.
5. Методическая разработка кафедры.
Страницы: 1, 2
|
