эмбрионов млекопитающих, в частности мышей. МакКиннел в одной из своих работ

отмечал, что все необходимые для этого методы уже существуют, и непонятно,

почему мышь до сих пор не клонирована. По его мнению, первыми объектами

должны были стать именно мелкие животные, такие как мышь или кролик. Однако

предсказание МакКиннелла не сбылось, хотя в конце 70-х годов опыты на мышах

действительно начались и протекали весьма драматично. К тому времени, замечу,

весьма основательно были изучены биология и генетика ранних этапов развития

млекопитающих, и, в частности, мыши как модельного объекта.

Работа методически оказалась довольно трудной, прежде всего потому, что объем

яйцеклетки у млекопитающих примерно в тысячу раз меньше, чем у амфибий.

Однако эти трудности были успешно преодолены. Экспериментаторы научились

микрохирургически удалять пронуклеусы из зигот (оплодотворенных яйцеклеток)

мыши и пересаживать в них клеточные ядра ранних эмбрионов. Однако все

полученные разными способами зародыши мышей развивались лишь до стадии

бластоцисты.

Пронуклеус - одно из двух гаплоидных ядер в яйце млекопитающих в период после

проникновения сперматозоида, но до слияния мужского и женского пронуклеусов в

ядро зиготы в процессе оплодотворения. Мужское ядро формируется из ядерного

материала сперматозоида, женское - из хромосом яйцеклетки.

Бластоциста (бластула) - зародыш млекопитающих на одной из ранних стадий

развития, еще до его имплантации в матку.

В 1977 году появилось сенсационное сообщение Хоппе и Илменси о том, что они

получили семь взрослых самок мышей, пять из которых имели голько магеринский, а

две - отцовский геном. Это, якобы, зависело от гого, какой пронуклеус был

оставлен в яйце - женский или мужской, он и определял развитие особи но типу

гиногенеза или андрогенеза. Их успех был связан, но описанию авторов, с гем,

что, удаляя один нронуклеус, они удваивали число хромосом другого, обрабатывая

яйца специальным веществом, затем выращивали полученные диплоидные гомочиготные

(с двумя одинаковыми наборами генов) зародыши in vitro до стадии

бластоцисты и пересаживали в матку самки-реципиента для дальнейшего развития.

Казалось, теперь можно будет быстро получать млекопитающих со 100%-ной

гомозиготностью по всем генам. Это особенно важно в селекции, так как для

получения сельскохозяйственных животных, в частности, крупного рогатого

скота, с закрепленными особо ценными качествами обычными приемами требуются

десятки лет работы.

Однако, к сожалению, данные Хоппе и Илменси подтвердить не удалось, хотя

многие пытались это сделать. Оказалось, что полученные любым способом

диплоидные андрогенетические и гиногенетические зародыши мышей погибают на

тех же стадиях, что и диплоидные партеногенетические (развивающиеся из

неоплодотворенной яйцеклетки) эмбрионы.

Значительно усовершенствовав методы извлечения ядер и введения их в клетку,

МакГрат и Солтер провели свою серию экспериментов и сообщили, что высокий

выход живых мышей они получили, когда в качестве доноров ядер использовали

зиготы, но если донорами были ранние эмбрионы, то реконструированные

яйцеклетки, как и прежде, развивались только до стадии бластоцисты .

Метод МакГрата и Солтера стал широко использоваться разными

экспериментаторами. Так, Манн и Ловел-Бадж выделяли пронуклеусы из яиц,

активированных к партеногенезу, и пересаживали их энуклеированные зиготы

мышей. В этих случаях эмбрионы погибали на ранних стадиях. Если же наоборот,

пронуклеусы получали из оплодотворенных яиц и пересаживали в

партеногенетически активированные и лишенные ядра яйца, то такие зародыши

развивались нормально до рождения. Сурани с соавторами установили, что если

добавить женский пронуклеус из зиготы мыши к гаплоидному набору хромосом

яйцеклетки, то нормального развития не происходит, добавление же мужского

ядра приводит к нормальному развитию. С другой стороны, рекомбинации мужского

и женского пронуклеусов из разных оплодотворенных яйцеклеток мышей

обеспечивает нормальное развитие, а комбинация двух мужских или двух женских

пронуклеусов останавливает развитие эмбриона.

Эти опыты показали, что для нормального развития млекопитающих требуются два

набора хромосом - отцовский и материнский. Поэтому ни у одного из известных

видов млекопитающих не описан партеногенез. Поэтому работы Хоппе и Илменси не

удалось повторить.

Однако эти исследователи еще дважды будоражили научное сообщество. В 1982

году они пересадили ядра клеток партеногенетических бластоцист мышей в

энуклеированные зиготы Некоторые из этих реконструированных яйцеклеток

нормально развивались, и якобы были получены четыре взрослых самки. В свете

вышесказанного эти результаты весьма маловероятны.

Гибель партеногенетических (гиногенетических) и андрогенетических зародышей у

млекопитающих связана с различной активностью в онтогенезе материнского и

отцовского геномов. Механизм, регулирующий эти функциональные различия, был

назван геномным импринтингом и изучался в ряде работ, где было показано, что

для нормального развития млекопитающих требуется наличие мужского генома.

Другая статья Илменси и Хоппе имела еще больший резонанс.

Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в

энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и

самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и

удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем

реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии

бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три

развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы

использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий

(7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из

работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и

достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней

клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro

реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии

бластоцисты. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность

развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных

яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы

или бластоцисты.

Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные

ядра рано теряют тотипотентность, что связано очевидно, с очень ранней

активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других

млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота,

активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-

клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании

эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем

не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно

расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.

Кролики, коровы и свиньи

Американские исследонатели Стик и Робл, используя методику МакГрата и

Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной

породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы. Фенотип родившихся

полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в

нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не

позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически

идентичных животных. Ценность этой работы тем не менее в том. что она

показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или

овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a

in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого)

реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного

(второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие

происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать

реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем

трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы. По данным одних авторов

реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной

среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при

культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без

прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером,

пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский

пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-

клеточных эбрионов коровы. Сначала зиготы центрифугировали чтобы освободить

пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны

под микроскопом (рис. 2а), что значительно облегчало их удаление (рис. 2б).

При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один

из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей (рис. 2в) и переносили его

в энуклеированную зиготу (рис. 2г).

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в

перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали,

освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой

работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали

пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два

зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их

завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра

2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не

развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности. сообщил, что ему

удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в

результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-

клеточного зародыша. Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет

тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-

клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных

яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в

матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и

дальше нормально развиваться.

Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные

зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку

синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка. Семь из них

были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате

пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно

долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие

реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности

клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но

остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью,

для клонирования взрослых животных.

Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа.

Скудность данных, видимо.и связана с определенными трудностями работы с этим

объектом.

Клонирование овец

Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной

стадии развития ядра сохраняют тотипотентность. Реконструированные

яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались

нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом

цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго

реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных

зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соотнетстиовал

породе овец - доноров.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и

ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец. В первом

случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе

овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок

погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы

считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация

некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже

не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное

развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве

доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in