|
Меню
|
|
|
|
|
|
|
Курсовая: Регистрация сигнальных молекул
|
|
|
Курсовая: Регистрация сигнальных молекул
содержание
| стр. | Список сокращений | | введение | | 1. обзор литературы | | 1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии | | 1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens | | 1.1.2. Cоздание векторов на основе Ti-плазмид | | 1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке и ее перенос в клетки растений | | 1.1.4. Разработка система трансформаций растений с помощью Agrobacterium tumefaciens | | 1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение | | 1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях | | 1.2. Использование метода генетической инженерии для трансформации однодольных растений | | 1.2.1. Краткие характеристики ряски | | 1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК | | 2. Материалы и методы | | 2.1. Материалы | | 2.1.1. Оборудование | | 2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды | | 2.1.3. Растения | | 2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений | | 2.1.5. Другие растворы | | 2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии | | 2.1.7. Антибиотики | | 2.2. Методы | | 2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений | | 2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens | | 2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну | | 2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli | | 3. результаты | | 4. обсуждение | | 5. выводы | | литературы | | приложение | |
СПИСОК СОкРАЩЕНИЙ
НУК – нафтиуксусная кислота
БАП – бензиламинопурин
MS –
LB –
тДНК –
Ар – ампицилин
Cs – цефотоксин
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность работы:
Свойство бактерий вида Agrobacterium tumefaciens вызывать у растений
корончато-галловую болезнь связано с присутствием в их клетках крупных (95-
156 мДа) конъюгированных Ti-плазмид (от англ. tumor-inducing – вызывающий
опухоль). В процессе идентифицирования растений часть генетического материала
Ti-плазмид – тДНК (от англ. transferred DNA – передаваемая) перемещается в
растительные клетки и интегрируется в хромосомы, оставаясь частью
наследственного материала. Гены тДНК экспрессируются в трансформарованных
растительных клетках, нарушают их фитогормональный баланс и определяют синтез
специфических ------- соединений.
Таким образом, агробактерии являются природными "генными инженерами",
осуществляющий поразительный по филогенетической дальности перенос
генетической информации. На основе агробактерий сконструированы эффективные
векторные системы для генетической инженерии растений.
Агробактириальная трансформация происходит в результате сложного процесса
взаимодействия между бактериальными и растительными клетками. В этом процессе
одной из решающих стадий является рецепция агробактериями особых сигнальных
молекул, присутствующих в экссудатах поврежденных тканей растений. Сигнальные
молекулы индуцируют экспрессию генов области vir (агробактериальных Ti-
плазмид), контролирующих вырезание тДНК и ее перенос в клетки растений.
Агробактерильная трансформация наблюдается у широкого круга голосеменных и
двудольных растений, однако, она отмечена лишь у весьма незначительного числа
однодольных растений. Одной из причин ограничений агробактериальной
трансформации однодольных считается присутствие в их клетках сигнальных
молекул, индуцирующих процессинг и перенос тДНК.
Цель работы:
В настоящее время имеются противоречивые данные относительно наличия таких
сигнальных молекул у однодольных растений. В связи с этим, целью данной
работы был анализ ряски на присутствие у них сигнальных молекул, индуцирующих
процессинг тДНК.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Использование Ti-плазмид агробактерий в генетической инженерии растений
1.1.1. Краткая характеристика Agrobacterium tumefaciens
За последнее десятилетие в области генетической инженерии растений достигнуты
значительные успехи. Были разработаны разнообразные методы генетической
трансформации и, в настоящее время осуществлена экспрессия чужеродных генов в
растениях многих видов. Наиболее важным для развития генетической инженерии
растений было открытие молекулярных основ опухолевых образований с помощью
Agrobacterium tumefaciens [7].
Вирулентные штаммы Agrobacterium tumefaciens (сем. Rirobiaceae)
характеризуются присутствием в клетках большой плазмиды, так называемой Ti-
плазмиды, весом более 150 т.п.н. (см. Приложение) [9].
Агробактерии вызывают опухолевый рост у многих двудольных и голосеменных, а
так же у некоторых однодольных растений [2,3]. Для инфицирования in vivo
необходимо повреждение тканей растения [12].
После прикрепления к клеточной стенке растительной клетки агробактерии
переносят часть Ti-плазмиды (так называемой тДНК) в ядро, где происходит ее
стабильная интеграция в хромосому растения.
Доказано, что функция распознавания клеток и прикрепления к ним, а так же
вырезание, перенос и, возможно, интеграция тДНК в растительный геном
кодируется двумя хромосомными генами – Chva и Chvb [13] и рядом генов vir-
области, находящихся на Ti-плазмиде [14].
После переноса в ядро растительной клетки, тДНК может интегрировать в геном в
виде одной или нескольких копий [15]. Встроенная тДНК имеет свойства,
характерные для ДНК эукариот, что показано в экспериментах по
гиперчувствительности к ДНК-азе I (Schafer, 1984). В зависимости от типа Ti-
плазмиды, в тДНК находится от семи до тринадцати генов, ответственных за
опухолевый фенотип. Гены 1 и 2 кодируют ферменты, участвующие в синтезе
ауксина, индолилуксусной кислоты, в то время, как ген 4 кодирует
изопентенилтрансферазу, синтезирующую цитокинин изопентенила денозин 5'-
монофосфат [16].
Одновременная транскрипция генов 1,2 и 4 приводит к повышению уровня
фитогормонов внутри трансформированных клеток. Результатом этого является
повышение митотической активности и образование опухоли. Другие гены тДНК
кодируют синтез так называемых опинов, из которых наиболее изучены нопапин и
октопин. Опины представляет собой производное аминокислот и сахаров, которые
служат источником питания для агробактерий [14]. В целом, образование
корончатого галла представляет собой хорошо охарактеризованный пример
генетической инженерии растений в природе.
Мутации в вирулентных генах агробактерий. Наличие Ti-плазмид в клетках
агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности
микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На
вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации,
картируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранние этапы
взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к
поверхности растительной клетки и специфическое связывание в центрах инфекции
контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосоме
расположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19].
Присоединение агробактерий к клеткам растения является одним из первых этапов,
определяющих эффективное взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens
контролируют два связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb,
размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [Дуглас и др, 1985]. Гены этих локусов
экспрессируются конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих
областей получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии.
Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии,
но не для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического
b-D-гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки
с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального b-D-гликана в инфекционном
процессе еще точно не установлена. Помимо циклического b-D-гликана в
прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают участие
и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды.
Организация vir-генов Ti-плазмид. Вирулентные гены
агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около
30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена
также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами
конъюгитивных плазмид. В ----- Ti-плазмидах в области vir локализовано шесть
различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый
регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет
дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et
al., 1984]. Мутации в генах и --------- vir A, vir G, vir B и vir D придают
агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных
мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.
Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной
клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном
растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но и
в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных репликонах).
Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются
в практике удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений
[Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК из плазмиды (точнее,
высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее переноса в растение
необходимо фланкирование этой области особыми границами: несовершенными
прямыми повторяющимися последовательностями ДНК размером 24 ---- ,
проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид.
Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области
сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв, служащий
началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе
транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в
материнской клетке и появление ее копии в дочерней.
Для нормального процессинга тДНК и ее переноса в растительную клетку особенно
важна ее правая граница, которая одна может определять полярность переноса
тДНК. Удаление правой границы из Ti-плазмид делает агробактерии полностью
авирулентными. Замена ее на искусственно синтезированную, так же как и на
левую, восстанавливает вирулентность микроорганизма.
На процессинг тДНК в клетках бактерий влияют мутации в генах vir D, vir C и
vir E – оперонов, на транспорт т-комплекса в растительную клетку – мутации в
генах vir B и vir D – оперонов.
1.1.2. Создание векторов на основе Ti-плазмид
В начале восьмидесятых годов были сделаны первые попытки перенести чужеродные
последовательности ДНК в растительные клетки либо с помощью транспозонного
мутагенеза [Uernals-teens et al., 1980], либо путем сайт-специфической
миграции генов в тДНК и последующей двойной рекомбинацией с Ti-плазмидой
дикого типа [Matrke et al., 1981; leemans et al., 1981]. Однако, эти ранние
эксперименты, основанные на двойной рекомбинации, занимали много времени,
были довольно сложны и трансформации проходили с очень низкой частотой.
Необходимо было разработать более эффективные векторы, чтобы облегчить
генетические манипуляции с бактериями и позволить селекцию и регенерацию
трансформатов.
Сейчас используют две принципиально разные системы для введения чужеродных
генов в растения с помощью Ti-плазмид:
1. ---- векторы
2. бинарные векторы.
В основе создания -------- векторов лежит тот факт, что гены тДНК не -------
для растительных клеток, и любая последовтельность ДНК, встроенная между
границами тДНК, может интегрировать в хромосому растительной клетки и
нормально там экспрессироваться [Zambryski et al., 1983]. В -------- векторых
системах тДНК можно заменить, например, на последовательность pBR322, а
чужеродную ДНК, которую предполагается перенести в растения, нужно
проклонировать в этом же векторе.
Затем путем гомологичной рекомбинации эта чужеродная ДНК может быть
перенесена на Ti-плазмиду реципиентного штамма агробактерии (рис. 2). Одним
из первых таких векторов на основании Ti-плазмид авляется pGV3850 [Zambryski
et al., 1983]. В нем все гены, ответственные за синтез фитогормонов, были
заменены на последовательность pBR322.
ДНК pBR322 обеспечивала гомологию для ------- области тДНК pGV3850 с любыми
производыми pBR, несущими клонированный ген.
Гены, кодирующие различные маркерные белки для быстрого отбора трансгенных
растений, были встроены в pGV3850 [De Blocle, 1984]. Была разработана система
трехродительного скрещивания для переноса любых производных pBR322 из E. coli
в A. tumefaciens pGV3850 [Van Haute et al., 1983]. В настоящее время
сконструированы и успешно используются и другие --- ---------- векторы на
основе Ti-плазмид [Royers et al., 1988].
Рис. 2.
Схемы -------- (А) и бинарной (Б) векторных систем. vir – область
вирулентности. HOM – области гомологии, в пределах которых может происходить
рекомбинация, приводящая к образованию коинтегратов. LB и RB – левая и правая
границы тДНК. MCS - ----- сайт для клонирования. РТМ – маркет трансформации
для растений. RES – маркер устойчивости к антибиотику для бактерий. OriT –
начало переноса и bom-сайт для мобилизации векторов при конъюгации. Col E1 –
начало репликации из плазмиды Col E1. RK2 – начало репликации из плазмиды
широкого круга хозяев RK2.
Система бинарных векторов основана на том, что область тДНК и гены vir могут
распологаться на разных плазмидах [Hockemu et al., 1983]. В таких системах
обычно присутствуют два элемента:
1) Ti-плазмида-помощник, в которой тДНК польностью делетирована. Эта
плазмида несет в своем составе гены vir, действующие in trans.
2) Плазмида широкого круга хозяев, имеющая сайты для клонирования и
маркерные гены для селекции растений, ограниченные правой и левой
фланкирующими последовательностями тДНК [An et al., 1988] рис
Обе описанные выше системы векторов предполагают --------- этапах сборку
нужных конструкций в промежуточных векторах, например в pAP2034 [Veltena,
Sehell., 1987] или pRT103 [Topter et al., 1983] а затем перенос из в готовом
виде в рецепиентные штаммы агробактерий.
1.1.3. Процессинг тДНК в бактериальной клетке
и ее перенос в клетки растений
Формы процессированной тДНК. При культивировании Agrobacterium tumefaciens с
механически поврежденными частями растений, регенерирующими протопластами или
в присутствии --------- из клеток бактерий можно выделить различные
молекулярные формы процессированной тДНК – одноцепочечные линейные,
двуцепочечные линейные и двуцепочечные кольцевые, которые могут претендовать
на роль посредника в переносе генетического материала в растительную клетку
[-------, 1980]. Причем кольцевая форма, образующаяся за счет гомологичной
рекомбинации между правой и левой границей тДНК с образованием одной
гибридной границы, встречается в очень малых количествах. При ее образовании
не происходит репликативного синтеза ДНК, в то время как в случае образования
двух других форм, возможно прохождение репликации тДНК в бактериах в процессе
ее транспотра в растения (к появлению одноцепочечных форм может приводить
прерывание, ингибирование прерывистого синтеза запаздывающей цепи).
Репликация призвана обеспечить сохранение тДНК в исходной Ti-плазмиде, если
только не допустить возможность существования физического вырезания материала
тДНК из Ti-плазмид за счет образования двухцепочечных разрывов в границах.
Исчезновение тДНК из Ti-плазмид является главным недостатком отошедшей на
второй план подобной "эксцезионной модели". Тем не менее, образование
двуцепочечных разрывов внутри границ и появление детектируемых количеств
линейной двуцепочечной формы тДНК при культивировании бактериальных клеток в
присутствии ---------- исследователи наблюдали уже через 30 минут после
добавления этого индуктора в среду. Так же в условиях индукции vir-генов ----
----- в клетках агробактерий обнаруживается линейная одноцепочечная форма
процессированной тДНК [Stachel et al., 1986].
Появление этого интермедиата обнаруживается через восемь часов после
добавления индуктора, и его количество накапливается на протяжении
последующих 40 часов более, чем в два раза, а затем идет на убыль, показывая,
что процесс лимитирован.
Какая из форм транслоцируется через бактериальную мембрану в бактериальную
клетку до сих пор остается не выясненным из-за трудности определения
относительного количества каждой из форм и выявления динамики их превращения.
Возможно, процессинг и транспорт тДНК не разобщены во времени и идут
сопряженно подобно конъюгационному переносу плазмид, происходящему в месте
контакта мембран конъюгирующих клеток [Clark and Warren, 1979]. Тогда все
обнаруживаемые интермедиаты могут быть аберрантными формами прерванного на
каком-то этапе неделимого процесса (или неправильно завершенного). В случае
индуцированной экспрессии vir-генов ------- отсутствует главный элемент
взаимодействия – контакт бактериальной клетки и растительной клетки, и,
поэтому, все обнаруживаемые в этом случае формы могут претендовать на роль
посредника лишь с определенными допущениями. Достоверно известно, что в
растительную клетку попадает только одна цепь тДНК и конвертируется в
двуцепочечную уже в растительной клетке. Обсуждается, что в случае
прохождения в клетке Agrobacterium tumefaciens -------- полуконсервативной
репликации тДНК вторая цепь может в процессе переноса гидролизоваться,
высвобождая энергию для транспорта переносимой цепи.
1.1.4. Разработка система трансформаций растений с
помощью Agrobacterium tumefaciens
Большинство первоначальных экспериметнов по генетической трансформации
растений было предпринято с помощью заражения пораненных растительных клеток
с помощью агробактерий с немодифицированными Ti-плазмидами. Для сохранения
стерильности часто инфицировали эксплантаты in vitro вместо целых растений.
Бактерии затем удаляли, добавляли в среду цефотоксин или карбенициллин.
Трансформанты отбирали на безгормональной среде.
В дальнейшем по мере создания обезоруженных векторов и новых селективных
маркеров, был разработан более эффективный метод, дающий большое число
трансформантов: кокультивирование агробактерий с растительными протопластами
либо с эксплантантами листьев. Было показано, что кокультивирование
протопластов с агробактериями, либо с бактериальными --------, приводит к
образованию опухоли [Marton et al., 1979, Wullems et al., 1981]. Затем
подобный подход был успешно применен для трансформации растительных клеток
агробактериями, несущими в составе тДНК химерные селективные маркеры [Fraley
et al., 1983, Herrera-Estrella et al., 1983].
Этот метод был в дальнейшем улучшен использованием так называемых фидерных
культур [Fraley et al., 1983]. Однако, все перечисленные методы пригодны
только для трансформации растений, которые можно легко регенерировать из
протопластов (например, табак и петуния). Эту проблему мрожно легко
преодолеть кокультивируя агробактерии с листовыми дисками вместо протопластов
[Horch et al., 1985; Rogers et al., 1986; Lloyd et al., 1986]. Стерильные
листовые диски --------- с агробактериями, несущими в составе обезоруженного
вектора какой-либо селективный маркер устойчивости к антибиотику. Затем
кусочки листьев культивируют два дня на фидерных чашках со средой для
образования побегов. После этого их переносят на среду с цефотоксином для
уничтожения бактерий и с каким-либо антибиотиком (например, с ---------) для
отбора трансформантов. Регенерировавшие побеги дают корни, после чего
растения переносят в почву для проведения дальнейших экспериментов.
Поскольку метод трансформации листовых дисков представляет собой идеальное
сочетание высокой частоты трансформации с легкой и быстрой ------- и
регенерацией трансформантов, этот подход стали использовать во многих
лабораториях мира. Кроме того были предложены некоторые модификации метода.
Для повышения частоты трансформации листовых дисков Arabiodopsis было
предложено обрабатывать агробактерии --------- [Sheikholeskam a. Week S,
1987], который является индуктором генов vir [Stachel et al., 1985]. Однако
метод трансформации листовых дисков применим для трансформации только тех
видов растений, которые могут регенерировать побеги из недифференцированных
клеток в месте поранения.
Наряду с методом трансформации листовых дисков широко используются
конъюгированные агробактерии со стеблевыми сегментами [An et al., 1986],
клетками суспензированной культуры [Scott a. Draper, 1987], микрокаллусами
[Pollock et al, 1985] и прорастающими семенами [Feldmam a. Markis, 1987].
Метод трансформации семян агробактериями был впервые применен для
арабидопсиса и заслуживает особого внимания, так как не требует работы с
культурой ткани.
1.1.5. Проблема сохранения чужеродных генов, перенесенных в растение
Чужеродные ДНК, перенесенные в растительные клетки с помощью различных
методов, обычно встраиваются в ядерный геном и наследуются в соответствии с
законами Менделя [De Block et al., 1984; Horsch et al., 1984]. Области
ингерации, по видимому, распределены случайным образом по геному.
Встраивание генов по определенным сайтам было ранее описано в системах
животных клеток [Smithies et al., 1985; Maniatis, 1985] и недавно подобный
подход был успешно применен для трансформации растений [Paszkowski et al.,
1988].
В большинстве случаев последовательности чужеродной ДНК встраиваются в один
локус либо в одной копии, либо в виде кластера тандемных вставок, что было
показано с помощью гибридизации in situ [Mouras et al., 1986]. Однако, часто
наблюдаются множественные вставки в два или более участков на разных
хромосомах [De Block et al., 1984; Peerbolte et al., 1986a, b; Feldmann a.
Marus, 1987]. В связи с этим во многих случах была получена контрансформация
физически несцепленных генов, сегрегация некоторых проходила в поколении F1
[De Framond et al., 1986; Simpson et al., 1986].
Чужеродыне гены обычно передаются потомству с высокой степенью стабильности
при мейозе [Muller et al., 1987]. Однако, иногда наблюдали случайную потерю
трансформированного фенотипа после мейоза [Potrykus et al., 1989].
Возмножно, это происходило из-за активации чужеродного гена (например, при
метилировании ДНК). Интеграция чужеродной ДНК во внеядерные геномы, например,
в хлоропластную ДНК [De Block et al., 1980], так же происходит по
неменделевскому типу наследования – по материнской линии.
Используя метод гибридизации по Саузерну [Southern, 1975] для анализа
трансформантов и их потомства, многие исследователи показали, что часто
наблюдается встраивание укороченных, тандемных или перестроенных копий
чужеродных генов, особенно после прямого переноса ДНК в протопласты [Krens et
al., 1985]. Появление тандемов, часто от 5 до 20 копий, можно объяснить рядом
рекомбинаций перед интеграцией в геном [Szernilofsky et al., 1986; Wirtz et
al., 1987]. Образование инвертированных повторов является основным типом
перестроек чужеродной ДНК при применении векторов, содержащих тДНК ----- Ti-
плазмиды [Jorgensen et al., 1987].
Итак, при проведении опытов по трансформации растений, необходимо принимать
во внимание тот факт, что чужеродная ДНК может подвергаться различным
модификациям перед встраиванием в геном хозяина. Однако, и после интеграции
могут происходить различные ее перестройки, обычно во время мейоза
[Czernilofsky et al., 1986]. В таких случаях только перекрестное опыление
тщательно отобранных трансформантов с наиболее желаемым генотипом и фенотипом
дает потомство с предсказуемыми призанаками.
1.1.6. Анализ экспрессии чужеродных генов в трансформированных растениях
Для качественного и количественного анализа экспрессии чужеродных генов в
растениях используют множество методов, включая Нозери-анализ РНК [Nagy et
al., 1988] и Вестери-анализ продуктов трансдукции [Burnette, 1981]. Кроме
того, изучают фенотипические признаки такие как, устойчивость к антибиотикам
и гербицидам. Для анализа экспрессии таких репортерных генов, как cat, npt
II, гены октопин- и -------- разработаны чувствительные методы [Otten a.
Schilperoort, 1987; Gorman et al., 1982].
Такого рода анализ может иметь большое значение, поскольку можно
комбинировать кодирующие последовательности репортерных генов с подходящими
регуляторными последовательностями растительных генов, либо создавать двойные
гены, экспрессирующиеся с одного и того же промотора. Активность гена и
промотора можно таким образом определить либо с помощью ферментативного
анализа, либо гибридизацией растительной РНК с зондами, комплементарными
репортерному гену.
Перечисленные выше разнообразные методики можно успешно применять для анализа
экспрессии чужеродных генов в трансгенных растениях, в частности, генов
устойчивости к гербицидам, насекомым, облучению, антибиотикам и др.
1.2. Использование метода генетической
инженерии для трансформации однодольных растений
1.2.1. Краткие характеристики ряски
Семейство рясковые, Lemnaceae включает 6 родов и 30 видов, встречающихся на
всех континентах. Наиболее широко они распространены в Северной и Южной
Америке, Африке, Австралии. Представители семейства рясковые являются самыми
маленькими в мире цветковыми растениями, венчики которых редко превышают 1
см. В результате гидрофильной эволюции они достигли крайней степени редукции
всех своих органов, поэтому и по простоте строения занимают первое место
среди цветковых.
Рясковые – водные, свободноплавающие, большей частью многолетние травянистые
растения. По своей природе рясковые являются неотеническими формами
произошедшими от предков современного водоплавающего рода Пистия из
семейства Ароидных. Рясковые служат кормом для диких и домашних уток, а
так же других водоплавающих и болотных птиц, для рыб, особенно карпа, и
ондатры. В сельском хозяйстве их используют в свежем и сушеном виде как ценный
белковый корм для свиней и домашней птицы. Применяются рясковые и для очистки
воды, так как извлекают из нее и запасают в своих листьях азот, фосфор, калий,
а так же поглощиют углекислый газ и обогащают воду кислородом. Употребляются и
человеком.
За последние 50 лет рясковые рассматриваются, как чрезвычайно ценный
экспериментальный объект для морфогенетических, физиологических и
биохимических исследований благодаря неприхотливости к среде, малым размерам,
быстрому росту, что позволяет использовать всего один генетический клон на
протяжении всего эксперимента.
1.3. Сигнальные молекулы, их способность индуцировать процессинг тДНК
Экспрессию генов vir-области индуцируют специфические сигнальные молекулы
посредством позитивной регуляции системы в состав которой входят гены virA и
virG [Melchers et al., 1986; Stackel, Zambryski, 1986].
Активаторами транскрипции vir-генов являются низкомолекулярные
моноциклические фенольные соединения, синтезируемые в механически
поврежденных тканях растений [Stuchel, 1985]. Примерами таких соединений
являются ----------- и довольно широкий круг производных -------
биосинтетического пути метаболитов защитной природы или предшественников
лигнина.
Сигнальные молекулы были впервые обнаружены в экссудатах корней и листьев
двудольного растения Nicotiano tabacum, они были идентифицированы как ----- и
-------. Эти соединения синтезировали метаболически активные поврежденные
ткани растений. В настоящее время установлена сигнальная индуцирующая
активность у большой группы ------- соединений растительной природы.
Механическое повреждение тканей растений приводит к усилению синтеза таких
сигнальных соединений. Известно, что ------------ и коричная кислоты,
проявляющие сигнальную активность, обладают так же антимикробными свойствами
и являются промежуточными метаболитами на пути синтеза -------. ----------
распознаются специфическими рецепторами агробактерий, являющимися
трансмембранными хеморецептргыми белками с различной ------- к таким
молекулам [Leroux, 1987]. Для оптимальной индукции экспрессии генов vir
требуется присутствие в эксцудатах растений различных углеводов: глюкозы,
глюкуроновой кислоты, галактозы, галактуроновой кислоты, арабинозы, маннозы,
фукозы, целлобиозы и ксилозы, представляющих компоненты клеточной стенки
растений. Такие углеводы связываются с периплазматическим доменом рецептора в
виде предварительно обработанного комплекса с белком-продуктом хромосомного
вирулентного гена Chv E, причем конечный результат индукции процессинга тДНК
зависит от синергической активности сигнальных соединений и сахаров
эксцудатов растений.
Структурная формула:
Позитивная регуляторная система vir A – vir G, контролирующая экспрессию
генов vir -----, работает следующим образом. Экспрессируемый конститутивно
ген vir A выполняет функцию рецепции сигнальных молекул растений и
трансмиссии этого сигнала в бактериальную клетку. Этот мембранный
хеморецептор после принятия внешнего сигнала активирует продукт гена vir G,
который в свою очередь выступает в качетве позитивного регулятора собственной
транскрипции и транскрипции остальных генов vir -----. Механизмы активации
следующие.
Белок vir A, дважды пронизывающий мембрану бактерии, при появлении сигнальных
молекул автофосфорилируется --------- на своем С-конце, переходя в активную
форму. (В отсутствии индукции С-терминальный домен белки vir A
взаимодействуют с W-терминальным доменом, ингибируя киназную активность).
Активированный белок vir A в свою очередь --------- внутренний клеточный
белок – трансдуктор сигнала vir a по остатку аспарагина – 52 [Jin et al.,
1990]. Фосфорилированный белок vir G связывается с промоторами остальных
генов регулона и со своим собственным, выступая в качестве транскрипционного
активатора. Индукция vir генов обратимая, и каскад реакций может быть
прерван, что очень важно для патогена: в случае, если хозяин больной и
нежизнеспособный организм, перенос тДНК в его клетки не осуществляется [Hess
et al., 1991].
Кроме позитивной регуляторной системы vir A – vir G, локализованной на Ti-
плазмиде, в регуляции экспрессии vir-генов принимают участие также
хромосомные гены. Об этом свидетельствует обнаружение спонтанного
хромосомного мутанта ros, у которого гены vir C и vir D – оперонов
экспрессируются в отсутствие сигнальных молекул растений.
3. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование
Копалка, термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф", прибор для горизонтального
электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.
2.1.2. Бактериальные штаммы и плазмиды
Штамм: | Escherichia coli HB 101 Agrobacterium tumefaciens C58C1 | Плазмиды: | рGV3850 | тДНК: | рBR322 маркер Ар, Тс |
Страницы: 1, 2
|
|
|
|
НОВОСТИ
|
|
|
|
|
|