|
минимальным механическим растяжением.
После 45 минутной инкубации МС окрашивание было также обнаружено кроме ИКК и
небольшого количества аксонов, в эритроцитах внутри капилляров и венул, в
тучных клетках в субмукозе и в интерстиции ЦМ. Гладкомышечные клетки не
окрашивались. В 1мм срезах ЦМ были контрастны во всех МС окрашенных лоскутов,
что определялось недостаточным количеством клеток. Ткани хорошо сохранялись.
ХотяИКК-ЦМ препараты, которые были преинкубированы МС в течении 7 минут не
показали видимого окрашивания, контрастность подмышечного ИКК слоя
уменьшалась после иллюминации с максимальныой интенсивностью в течении 4010
минут как было установлено в случае окрашивания толуидином синим. Эти
наблюдения коррелировали с ультраструктурными изменениями.
Электронная микроскопия: Контрольные данные – иллюминация без МС
никаких ультраструктурных изменений не было обнаружено в ИКК-ЦМ препаратах
(n=11, 2-10 мин иллюминация), которые освещались в течении 10 минут с
максимальной интенсивностью без инкубации в МС. Три типа клеток, интимно
связанных щелевыми соединениями и промежеуточными контактами присутствовали
вдоль всего внутреннего края препаратов. ИКК соединяются с тонкими ветвистыми
гладкомышечными клетками (ВКМК), которые в свою очередь формируют щелевые
контакты и межуточные соединения с глубоко лежащими крупными клетками ЦМ.
Взаимодействие между этими типами клеток было важным, так как авторы
обнаружили, что окрашивание МС и заметное повреждение после инкубации в МС и
иллюминации были ограничены для ИКК, более чем для ВГМК и типичных
гладкомышечных клеток. Хотя индивидуальный профиль клеточных отростков часто
было невозможно классифицировать, то три типа клеток могут быть
классифицированы сравнением ядерных частиц клеток:
1. ИКК были высоко разветвлёнными клетками с 2 или 5 первичными
отростками, профили клеток, которые включали ядро, в соновном также содержали
начало 1 или 2 первичных отростков. Перинуклеарная цитоплазма между началом
отростков была очень тонкой. В начале отростков перинуклеарная цитоплазма
доминировала большой аккумуляцией митохондрий. Часть цитоплазмы была занята
узлами филамент с малыми тельцами ассоциированными с цитоплазмой и мембраной.
Когда последние сравнивались с расположением плотных телец в гладкомышечных
клетках (ЦМ и ВГМК), оказалось, что в цитоплазме ИКК их мало. Разбросанные
микротубулы всегда присутствовали в перинуклеарной цитоплазме. Обширный
эндоплазматический ретикулум состоял из системы переплетающихся соединённых
между собой цистерн, организованных частично между и вокруг митохондрий,
частично соединённых с тонкими цистернами. Цистерны были преимущественно
тонкого типа, с грубой частью, характеризуемой широко разбросанными
рибосомами.
2. Выше перечисленные черты были типичны для ИКК, но не для ВГМК или ЦМ.
В ВГМК и ЦМ митохондрий было меньше и они были беспорядочно разбросаны.
Профили подобные тем, что изображены на фотографиях 5а и 6а были типичны в
случае, если плотность митохондрий в ВГМК меньше соответствующей величины в
ИКК. Перинуклеарная цитоплазма была заполнена плотно расположенными
филаментами (тонкого, толстого и промежуточного типов) со схожей структурой
плотных телец (ассоциированные с цитоплазмой и мембраной) в ВГМК и ЦМ. ВГМК
может быть отличена от ЦМ размером (более тонкие области перинуклерных
филамент и более тонкие отростки у ВГМК) и нерегулярным появлением
ветвистости в ВГМК. Ядерная морфология была схожей в ИКК, ВГМК и ЦМ.
Хотя могут обнаруживаться некоторые вариации ультраструктур при осмотре
полусерийных срезов, профили больших отростков трёх типов клеток в общем
могут быть классифицированы по критериям перечисленным выше.
Ультраструктура после инкубации в МС.
Целостная структура клеток и субклеточные детали не поражались МС как
указывалось прежде. После 7 минутной инкубации в МС, во всех 3 типах клеток
не обнаруживалось каких-либо изменений. Единственным постоянным изменением,
наблюдавшимся во всех препаратах был переход митохондрий от конденсированной
(расширенные внутрикристовые пространства и плотный матрикс) к ортодоксальной
конформации (узкие кристы и разреженный матрикс) в ИКК. В противоположность
этому, у гладкомышечных клеток митохондрии находились в различной конформации
до и после обработки МС и светом. Никаких доказательств в пользу конформации
митохондрий в гладкомышечных клетках (ГКМ) получено не было.
После инкубации в МС иллюминация в течении 4 и 10 минут вызывала серьёзные
повреждения в ИКК и малом количестве ГКМ разбросанных по краю подмышечного
слоя. После 4 минутной иллюминации самыми выдающимися изменениями в ИКК были
увеличение митохондрий и увеличение вакуолизации цитоплазмы (n=3). После 10
минут иллюминации (n=3, фотографии 6в) ИКК были увеличенными имели низкую
контрастность цитоплазмы, отлично различимые митохондрии, несколько кавеол и
отверстия в плзматических мембранах, что вероятно говорило о её разрыве.
Идентификация ИКК была возможной благодаря сохранению базальной пластинки
и совместно с чертами цитоплазмы (такими как число митохондрий) и сохранению
взаимосвязей с глубоколежащими клетками.
ОБСУЖДЕНИЕ.
Избирательное повреждение толстокишечных ИКК метиленовым синим и светом.
Авторы установили строгую очевидность того, что подмышечные ИКК незаменимы в
генерации потенциалов действия медленных волн в ЦМ толстого кишечника собак
непосредственно показав связь между избирательным повреждением ИКК и
исчезновением медленных волн при этом. В свежих исследованиях авторы
показали, что ИКК в подмышечном сплетении избирательно аккумулируют МС и что
МС не вызывает каких-либо микроскопически заметных изменений в любых типах
клеток, кроме он не имеет значительного эффекта на активность медленных волн.
В настоящем исследовании авторы показали, что интенсивная иллюминация после
инкубации в МС приводит к специфическому повреждению ИКК подтверждаемому
элетронной микроскопией. Более того, когда ЦМ препараты, у которых были
удалены подмышечные ИКК-ГМ сети, были инкубированы в МС с последующей
иллюминацией , спонтанная и индуцируема электрическая активность не
затрагивалась. Эти наблюдения указывают на то,что эффекты МС и света на ИКК-
ЦМ препараты были специфичны только для ИКК, не связанных с ГМК.
Хотя устранение активности медленных волн МС и светом сопровождалось
деполяризацией, последняя не была ответственна за ингибирование активности
медленных волн, с того момента, как реполяризация клеток к их прежнему
потенциалу покоя не восстанавливала медленные волны. Кроме того, было
замечено, что медленные волныустраняются в большом диапозоне величин
мембранных потенциалов, включая мембранный потенциал покоя, свойственный
циркулярным мышцам, что указывает на , что изменения активности медленных
волн не вызваны изменениями величин мембранных потенциалов. В
противоположность этому, строфантин также деполяризует мембраны и при этом
устраняет активность медленных волн (1). Тем не менее, реполяризация мембран
к изначальному потенциалу покоя полностью восстанавливает активность
медленных волн. Это указывает на то, что в присутствии строфантина,
ингибирование активностимедленных волн - непосредственный эффект
деполяризации.
Локализация аккумуляции МС внутри ИКК очень специфична. Когда преципитация
МС была проведена так, что удалось избежать перемещения и образования грубых
преципитатов было обнаружено, что электронно-плотные депозиты присутствуют
только в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) и его нет в других
цитоплазматичексих компонентах (35). Это может указывать на то, что МС входит
в ЭР непосредственно путём проникновения через пгладкие цистерны. Тем не
менее, остаётся неясным почему МС накапливается в ЭР ИКК, но при тех же
обстоятельствах не входит в ЭР ГМК. В опытных условиях настоящего
исследования, изменения в конформации митохондрий так же как активности
медленных волн были обнаружены при минимальной инкубации МС в течении 7
минут и минимальной иллюминации в течении 2 минут, что наводит на мысль о
том, что первичной причиной устранения медленных волн является повреждение
митохондрий.
Фотодинамическое цитотоксическое действие МС было известно многие годы (2).
Недавно изучалась цитотоксическая эффективность фотоинактивации МС-
чувствительных клеток рака желчного пузыря (10), включая и сопровождающие её
ультраструктурные изменения (39). После короткого периода иллюминации (5
минут), докладывалось, что ультраструктурные изменения были идентичны
данным авторов (дизинтеграция митохондрий и ранние признаки повреждения
плазматических мембран) , а высокая продолжительность иллюминации вела к
разрыву мембран клеточной фрагментации. В исследования фотодинамического
действия МС на ДНК (23) было показано, что обратимые предповреждения ДНК,
вызванные МС в темноте становятся необратимыми когда к инкубации в МС
присоединяется иллюминация. Вот и в этом исследовании электрофизиологические
эжффекты и ультраструктурные эффекты МС и света также были необратимыми.
Роль ИКК в генерации медленных волн.
Настоящее исследование подкрепляет гипотезу о том, что ИКК незаменимы для
генерации активности водителя ритма в кишечнике. В подобных исследованиях,
использующих тонкий кишечние мышей иллюминация светом красного лазера
устраняла внутриклеточно записанную активность медленных волн после
инкубации в МС (36). Было показано, что активность медленных волн поражается
в препаратах где ИКК окрашивались МС и не поражается, где ИКК не
окрашивается. В другом исследовании (37), спонтанная сократительная
активность медленных волн была сохранена, когда в культурируемых кусочках
мускулатуры тонкого кишечника мышей окрашенные МС ИКК были просмотрены под
микроскопом в очень тусклом свете, но эти кусочки быстро становились
неподвижными при сильном освещении.
Настоящее исследованиеспецифически устанавливает решающую роль ИКК в
генерации медленных волн в толстом кишечнике собак как показывалось прежде
(12,18,19,21,29). Авторы выдвигают гипотезу о том, что циклическая
внутриклеточная активность периодически активирует токи водителя ритма. В
этом случае ИКК могут являться или биохимическими часами или одновременно
биохимическими часами и ионными каналами, отвечающими за генерацию тока
водителя ритма. Хотя спонтанные осциляции, записанные в изолированных ГМК
(25) и клетках близких по описанию к ИКК (17,26), и устранялись блокаторами
кальциевых каналов L-типа и следовательно не отражают медленные волны, как
компонент водителя ритма, которые в принципе этими блокаторами не устраняются
(14). Таким образом, спонтанно происходящие осциляции не имеют характеристик
медленных волн.
Следующий вопрос касается роли ГМК в генерации медленных волн, как компонента
водителя ритма. Ветвистые ГМК, которые интимно соединяютс с ИКК соединительными
щелями представляют особый интерес. Если ИКК единственные клетки ответственные
за генерацию токо водителя ритма, то величина тока, которую каждая ИКК должна
генерировать, чтобы деполяризировать все соседствующие с ней клетки с высоким
сопротивлением поверхности, должна быть огромной. Возможно и другое: ИКК –
это биохимические часы и ИКК посылают внутриклеточные метаболиты через
соединительные щели в интимно соединённые с ними ГМК. Благодаря такой
метаболической связи (8) ассоциированные ГМК могут находиться в синхронии с
ИКК, когда каналы водителя ритма и в ИКК и в ассоциированных с ними ГМК –
активированы. Обоснование этой части гипотезы требует идентификации каналов
водителя ритма и доказательства существования таких каналов в ИКК и ГМК.
Интересен тот факт, что в присутствии тетраэтил аммония, BaCl2 и
карбохола, изолированный слой ЦМ без подмышечной рабочей сети ИКК-ГМК
генерирует потенциалы действия, которые идентичны по частоте с медленными
волнами, но устраняются блокаторами кальциевых каналов L-типа (D-600) (18). Это
и последующее исследование (20) показали, что ЦМ без подмышечной рабочей сети
ИКК-ГМК может генерировать потенциалы с характеристиками подобными активности
медленных волн.
Активность медленных волн также исчезает после обработки тканей Родалином
123 в полнослойных препаратах мышц (38). Родалин 123 – специфический маркёр
митохондрий, и таким образом он не специфичен для ИКК, хотя ИКК особенно
богаты митохондриями. После проникновения в митохондрии, Родалин 123
становится цитотоксичным благодаря разрушению АТФ (24). Следовательно,
эффект Родолина 123 наводит на мысль о том, что активность медленных волн
находится в строгой зависимости от внутриклеточного метаболизма. Это
согласуется с наблюдениями о том, что активность медленных волн чувствительна
к высоким температурам (1), блокируется ингибиторами метаболизма, такими как
динитрофенол и карбонил цианид (H. Preiksaitis и J.D. Huizing,
неопубликованные данные) и поражается при изменении конформации митохондрий
(настоящее исследование). Это поддерживает гипотезу авторов о том, что
компонент медленных волн водителя ритма образуется благодаря внутриклеточному
метаболизму.
Таблицы, графики и изображения.
Таблица 1. Эффекты инкубации в 50 мМ метиленового синего (45 минут) на
электрическую активность препаратов ИКК-ЦМ с или без иллюминации
Параметры | В растворе Кребса | +Метиленовый синий | +Свет | Мембранный потенциал покоя, мВ | -72,8+-0,8 | -70,6+-0,9 | -47,3+-1,9 -69,7+-1,6 | Частота, циклов/минуту | 5,3+-0,2 | 5,0+-0,2 | | Продолжительность, с Амплитуда действия, мВ | 3,8+-0,3 38,6+-1,4 | 4,9+-0,7 37,4+-1,5 | | Амплитуда плато, мВ | 34,1+-1,3 | 33,2+-1,6 | | Частота колебаний, мВ/c | 192,3+-23,8 | 169,4+-18,7 | | |
График 1. Электрофизиологические эффекты иллюминации на
окрашенные МС препараты ИКК-ЦМ.
А: МС (45 минутная инкубация) немного снижает мембранный потенциал покоя и
увеличивает продолжительность медленных волн. Эти эффекты исчезают после
промывки препаратов от МС в растворе Кребса в течении 5 минут. Препарты затем
освещались с максимальной интенсивностью. В последующем, амплитуда медленных
волн снижалась при этом мембранный потенциал покоя уменьшался до –44мВ.
Реполяризация мембран не востанавливала активность медленных волн, что
указывает на то, что устранение медленных волн является следствием
ингибирования механизма генерирования медленных волн и не вызвана
деполяризацией.
В: Уменьшение интесивности света на 1/3 от того, что было в опыте А
значительно удлиняет период иллюминации, требуемый для устранения медленных
волн. В этом эксперименте наблюдались медленные волны большей продолжительности
во время периода деполяризации. Медленные волны устранялись при величине
мембранного потенциала покоя –42 мВ.
График 2. Эффекты мембранного потенциала на активность медленных волн.
А: после 45 минутной инкубации в МС и промывки в растворе Кребса, препараты
освещались с 1/3 максимума интенсивности до тех пор пока амплитуда медленных
волн не станет равна половине таковой в растворе Кребса. Препараты были
реполяризованы к такому же мембранному потенциалу покоя как и в растворе
Кребса. В данном случае восстановления амплитуды медленных волн не
наблюдалось.
В: в противоположность этому, в случае когда деполяризация была вызвана
повышением внеклеточной концентрации К+ до 15 мМ в растворе
глюкамин-нитрендипин-Кребса, реполяризация препаратов ИКК-ЦМ с использованием
метода анологичному в опыте А полностью восстанавливала амплитуду медленных
волн. Кроме того, амплитуда медленных волн также восстанавливалась после
промывки.
Таблица 3. Устранение активности медленных волн МС+свет без
заметной деполяризации. Медленные волны устранялись в МС окрашенных препаратах
ИКК-ЦМ с освещением 1/3 максимума интесивности света на протяжении 8,5 минут.
Медленные волны Медленные волны устранялись при величине потенциала –64 мВ, что
равно истинной величине мембранного потенциала покоя препаратов циркулярных
мышц в растворе Кребса. (см. График 4)
Таблица 4. Электрофизиологические эффекты МС+свет на
препараты ЦМ. Препараты ЦМ, лишённые подмышечной сети ИКК и нескольких
прилежащих слоёв ГМК были спонтанно помежены в раствор Кребса. Инкубация в 50
мМ МС не вызвала изменений мембранного потенциала, чего не сделала и 3 минутная
иллюминация с максимумом интенсивности. Было показано, что препараты ЦМ
жизнеспособны при стимуляции 0,5 мМ BaCl2 + 0,1 BAY K 8644.
Изображение 5.
А: электронная микрофотография подслизистого края в контрольной ткани.
Иллюминация с максимальной интенсивностью в течении 10 минут без преинкубации в
МС не имеет эффектов на ультраструктуру ИКК ( митохондрии не конденсированы),
тонкие нерегулярные ветвистые гладкомышечные клетки (ВГМК), нервы (Н) и
собственно циркулярные мышцы (ЦМ).
SUB: подслизистая
В и С: обратите внимание, ИКК после инкубации в МС в течении 45 минут, без
последующей иллюминации (В) или с 2 минутной иллюминацией с максимумом
интенсивности (С) претерпели изменение конформации митохондрий от
конденсированной в ортодоксальную. В отличие от этого, ультраструктура
сохранена, включая щелевые контакты (ЩК).
Изображение 6. Ткань инкубированная в МС в течении 7 минут с
последующей иллюминацией максимумом интенсивности в течении 2 (А) и 10 минут
(В).
А: после 2 минутной иллюминации единственные ультраструктурные изменения -
это появление митохондрий с ортодоксальной конформацией ( сравните с
изображением 5С: 45 мин в МС, 2 мин в свете). IC – интерстициальные клетки
Кэйджела, bSM - тонкие нерегулярные гладкомышечные клетки, CM - собственно
циркулярные мышцы, N – нерв подмышечного сплетения.
В: после 10 минутной иллюминации, ИКК серьёзно повреждены – дизинтеграция
цитоплазматических органелл и разрывы плазматической мембраны. Базальная
пластинка ещё интактна. Отростки ВГМ и ЦМ клеток повреждены значительно
меньше.
Изображение 7.
А: Слабосильная электронная микрофотография ткани освещённой в течении 10
минут с максимумом интенсивности после 7 минутной преинкубации в МС. Нет
никакого указания на структурые повреждения собственно ЦМ, внутримышечных
капилляров (К) и фибробластов (Ф), в то время как слой клеток, граничащих с
субмукозой (СУБ) значительно поражён.
В: при высоком увеличении ( те же условия ) большие повреждения ограничены
ИКК богатыми митохондриями, в то время как тонкие нерегулярные ВГМК, ЦМ и
нервы не повреждены. Сохранены щелевые контакты между глубоко лежащими ЦМ
клетками и между ИКК.
Страницы: 1, 2
|
